Herzvorläuferzelle

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 800 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind von Zellen abgeleitete, in einer Lipiddoppelschicht eingeschlossene Partikel, die eine Rolle bei der interzellulären Kommunikation spielen. Es wurde gezeigt, dass von kardialen Vorläuferzellen (CPC) abgeleitete EVs das Myokard über proangiogene Wirkungen vor Ischämie-Reperfusionsschäden schützen. Die Mechanismen, die der CPC-EV-induzierten Angiogenese zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar. Hier entdeckten wir, dass die Fähigkeit von CPC-EVs, In-vitro-Angiogenese zu induzieren und überlebensfördernde Signalwege zu stimulieren, verloren ging, wenn EV-Spenderzellen Kalziumionophor ausgesetzt wurden. Der proteomische Vergleich aktiver und nicht aktiver EV-Präparate sowie die phosphoproteomische Analyse aktivierter Endothelzellen identifizierten den Beitrag des Kandidatenproteins PAPP-A und des IGF-R-Signalwegs bei der EV-vermittelten Zellaktivierung, was mithilfe von In-vitro-Angiogenese-Assays weiter validiert wurde . Bei weiterer Reinigung mittels Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation verloren die EVs teilweise ihre Aktivität, was auf eine co-stimulierende Rolle von co-isolierten Proteinen bei der Aktivierung der Empfängerzellen schließen lässt. Unser verbessertes Verständnis der Mechanismen der CPC-EV-vermittelten Zellaktivierung wird den Weg für effizientere EV-basierte Therapeutika ebnen.

Ein Myokardinfarkt führt zu einem massiven Verlust von Kardiomyozyten, was zu Narbenbildung und Herzumgestaltung führt, die zu einer Beeinträchtigung der Herzfunktion und fortschreitend zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz führen. Obwohl eine Herzinsuffizienz durch die derzeit verfügbaren Therapien nicht verhindert werden kann, haben aktuelle Tierstudien gezeigt, dass die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt durch die therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel (EVs), die aus Stammzellen und kardialen Vorläuferzellen (CPC) stammen, verbessert werden kann1,2 .

EVs sind aus Zellen stammende Nanopartikel, die von einer Lipiddoppelschicht umgeben sind, biologische Fracht wie RNA, Proteine ​​und Lipide enthalten und eine Rolle bei der normalen zellulären Homöostase und interzellulären Kommunikation spielen3. Elektrofahrzeuge haben die Fähigkeit, Zielzellen durch das Vorhandensein von Adhäsionsmolekülen und Rezeptoren sowie durch die Abgabe bioaktiver Moleküle aus der Elternzelle zu aktivieren2,4. Nach der In-vivo-Verabreichung modulieren die von Sca+ CPCs freigesetzten EVs regenerative Prozesse im Herzen, indem sie die Angiogenese fördern, die Fibrose verringern und die Apoptose der Kardiomyozyten hemmen und dadurch zur Herzreparatur beitragen5,6. Es wurde gezeigt, dass Elektrofahrzeuge, die aus anderen Stammzellquellen stammen, unterschiedliche miRNAs und Proteine ​​an verschiedene Zellen im Herzen abgeben, um die Erholung des Herzens zu fördern7,8,9. Trotz Versuchen, die CPC-EV-Zusammensetzung zu dokumentieren, mangelt es weiterhin an funktionellen und mechanistischen Studien, die genau klären, welche Komponenten im komplexen Proteinrepertoire für die Reparaturfunktion verantwortlich sind. Darüber hinaus wird die klinische Anwendung von aus Stammzellen gewonnenen Elektrofahrzeugen durch Reproduzierbarkeitsprobleme behindert, die unter anderem mit Unterschieden in der therapeutischen Aktivität zwischen verschiedenen Elektrofahrzeugisolierungen zusammenhängen10,11. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) hat sich weithin als bevorzugte Methode zur EV-Isolierung etabliert12,13. Allerdings liefert es, wie die meisten Methoden bisher, keine vollständig reine EV-Population. Es wurde spekuliert, dass co-isolierte Proteine, die in EV-Präparaten vorhanden sind, zu ihrer therapeutischen Funktion beitragen könnten14,15,16,17,18. Daher ist eine tiefergehende funktionelle Charakterisierung des CPC-EV-Gehalts und die Lokalisierung dieses Inhalts in CPC-EV-Präparaten erforderlich, um bessere Einblicke in die Wirkmechanismen zu erhalten, die zu einer reproduzierbareren therapeutischen Anwendung von CPC-EVs führen. In dieser Studie wollten wir die proteinvermittelten Auswirkungen von CPC-EVs auf Endothelzellen aufklären. Zunächst identifizierten wir die funktionellen Proteinkomponenten von CPC-EVs, die an der Aktivierung menschlicher mikrovaskulärer Endothelzellen (HMEC-1) beteiligt sind, indem wir den Gehalt an funktionellen und nicht-funktionalen (CPC-) EV-Präparaten verglichen. Als nächstes untersuchten wir den Beitrag der einzelnen EV-assoziierten Proteine ​​Schwangerschafts-assoziiertes Plasmaprotein A (PAPP-A) und Nidogen-1 (NID1) zur CPC-EV-vermittelten Angiogenese durch die Erzeugung von Knock-out (KO)-EVs unter Verwendung von CRISPR /Cas9-Technologie. Schließlich untersuchten wir den Beitrag von EV-assoziierten im Vergleich zu co-isolierten Proteinen zur CPC-EV-Funktion durch den Einsatz einer Iodixanol-Gradientendichte-basierten Reinigung.

Im Herzen wurde gezeigt, dass proreparative Effekte, die durch die Verabreichung von CPCs und von CPC abgeleiteten EVs hervorgerufen werden, durch die Förderung der Angiogenese vermittelt werden19,20,21. Um das proangiogene Potenzial unserer CPC-EVs in vitro zu bestätigen, wurden EVs aus serumfreiem konditioniertem Medium unter Verwendung von SEC wie zuvor beschrieben12 isoliert. Die erfolgreiche Isolierung von CPC-EVs wurde durch NTA bestätigt, das eine Größenverteilung mit einem Peak bei ~90 nm zeigte (Abb. 1a). Western Blot bestätigte gemäß den MISEV2018-Richtlinien22 die relative Anreicherung der EV-Markerproteine ​​CD81, CD63 und Annexin A1 in EVs im Vergleich zu Zelllysat und das Fehlen des endoplasmatischen Retikulumproteins Calnexin (Abb. 1b). Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) des CPC-EV-Präparats zeigte das Vorhandensein von Vesikeln mit einer Doppelblättchenmembran (Abb. 1c). Die Oberflächenladung (Zeta-Potenzial) von Elektrofahrzeugen war negativ, –19,3 mV, gemessen durch Laser-Doppler-Elektrophorese (Abb. 1d).

ein repräsentatives NTA-Diagramm, das die Größenverteilung und Partikelkonzentration von EVs zeigt, die mithilfe der Größenausschlusschromatographie aus dem konditionierten Medium von CPCs (CPC-EVs) isoliert wurden. b Western-Blot-Analyse, die das Vorhandensein von CD81, CD63, Annexin A1 (ANXA1), β-Actin (β-ACT) und das Fehlen von Calnexin (CNX) in CPC-EVs zeigt. β-ACT und CNX waren im CPC-Lysat (CL) vorhanden. c Repräsentatives TEM-Bild von CPC-EVs. d Oberflächenladung (Zeta-Potenzial) von CPC-EVs, gemessen durch Laser-Doppler-Elektrophorese. e, f Repräsentative Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem AKT (pAKT), Gesamt-AKT (tAKT), phosphoryliertem ERK1/2 (pERK1/2) und Gesamt-ERK1/2 (tERK1/2) in HMEC-1, behandelt mit zwei verschiedenen CPC-EV Partikeldosen (Dosierung basierend auf Ref. 12). f Quantifizierung der pAKT-, tAKT-, pERK1/2- und tERK1/2-Expressionsniveaus mittels Densitometrie, ausgedrückt als pAKT/AKT- und pERK/ERK-Verhältnisse (n = 4). g Wundheilungstest, der die Auswirkungen von CPC-EVs auf die HMEC-1-Migration 6 Stunden (t6) nach EV-Zugabe (t0) zeigt, analysiert sowohl als relativer %-Wundverschluss als auch als relative absolute Migrationsstrecke im Vergleich zu PBS (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,033; **p < 0,0021.

Frühere Studien haben die Aktivierung der Signalwege Mitogen-aktivierte Proteinkinase1/2 (MAPK1/2), extrazelluläre signalregulierte Kinase1/2 (ERK1/2) und PI3-Kinase/AKT in HMEC-1 nach CPC-EV-Verabreichung gezeigt12. Tatsächlich stiegen die AKT- und ERK1/2-Phosphorylierungswerte innerhalb von 30 Minuten nach der Zugabe von CPC-EVs dosisabhängig an (Abb. 1e, f). Die Fähigkeit von CPC-EVs, Endothelzellen funktionell zu aktivieren, wurde in einem HMEC-1-Kratzwundentest bestimmt. Die Zugabe von 2 × 1010 CPC-EVs zu gekratztem HMEC-1 induzierte eine Zellmigration, die sowohl durch den Prozentsatz des Verschlusses als auch durch die absolute Migrationsstrecke im Vergleich zu PBS bestimmt wurde (Abb. 1g), während die Gesamtzellzahl, die durch den Gesamtproteingehalt in HMEC bestimmt wurde, keinen Einfluss hatte -1 Lysate (Ergänzende Abb. 1a). Dies bestätigte die proangiogene Aktivität von CPC-EVs in vitro.

Um den migrationsfördernden CPC-EV-Inhalt besser untersuchen zu können, haben wir uns zunächst vorgenommen, die CPC-EV-Freigabe zu veranlassen. Es wurde beschrieben, dass Calciumionophor A23187 die EV-Freisetzung durch Erhöhung der intrazellulären Calciumspiegel stimuliert23,24,25,26. Um die durch Calciumionophor induzierte EV-Freisetzung durch CPCs zu untersuchen, wurden CPCs entweder unbehandelt gelassen (0,0125 % DMSO, Veh-EVs) oder 24 Stunden lang 1 µM Calciumionophor (Ca-Ionen-EVs) ausgesetzt. Anschließend wurden EVs mittels SEC aus serumfreiem konditioniertem Medium isoliert. Größe und Gesamtzahl der freigesetzten Elektrofahrzeuge wurden durch die CPC-Exposition gegenüber Calciumionophor nicht beeinflusst, wie durch NTA bestimmt (Abb. 2a). TEM bestätigte das Vorhandensein runder, membranumschlossener Partikel in beiden EV-Präparaten (Abb. 2b). Beide EV-Isolate zeigten die EV-Markerproteine ​​CD81, CD9 und ALIX, obwohl ihre Anwesenheit in Ca-Ionen-EVs reduziert war (Abb. 2c). Ca-Ionen-EVs hatten im Vergleich zu Fahrzeug-EVs einen etwas geringeren Gesamtproteingehalt pro 1 × 1010 Partikel (Abb. 2d). Daher wurde in nachfolgenden Experimenten die EV-Supplementierung zwischen den Bedingungen sowohl hinsichtlich der Gesamtpartikelzahl als auch der Gesamtproteinmenge normalisiert, um eine Verzerrung bei der Interpretation der EV-Funktionalität aufgrund von Unterschieden in der EV-Reinheit zu verhindern. Bemerkenswerterweise induzierte die Veh-EV-Stimulation die AKT- und ERK1/2-Phosphorylierung in HMEC-1, während die Ca-Ionen-EV-Stimulation dies nicht tat, und zwar beides, wenn die EV-Zugabe basierend auf der Partikelanzahl normalisiert wurde (Abb. 2e, f, ergänzende Abb. 9a, b). ) und auf Gesamtproteinspiegel (Abb. 2g, h, ergänzende Abb. 9c). Aus SKOV-3-Zellen freigesetzte Elektrofahrzeuge wurden gleichzeitig isoliert und charakterisiert, da zuvor gezeigt wurde, dass sie nicht in der Lage sind, AKT- und ERK1/2-Signale zu induzieren (ergänzende Abbildung 1b, c). Tatsächlich waren SKOV-3-EVs im Vergleich zu Veh-EVs bei der Induktion der AKT- und ERK1/2-Phosphorylierung unwirksam (ergänzende Abbildung 1d – g) und wurden daher als nicht funktionelle Nicht-Stammzellkontrolle einbezogen. Darüber hinaus induzierte die Veh-EV-Stimulation, jedoch nicht die Ca-Ionen-EV-Stimulation, die HMEC-1-Migration in einem Wundverschluss-Kratztest (Abb. 2i) und stimulierte die Sprossenbildung in einem HMEC-1-Sprossentest (Abb. 2j, k). Diese Unterschiede in der EV-Funktionalität lassen darauf schließen, dass die Behandlung mit Calciumionophor den EV-Gehalt beeinflusst, obwohl sie die gesamte EV-Freisetzung nicht erhöht. Dieser Befund zur Isolierung sowohl funktioneller als auch nicht-funktionaler EV-Populationen aus CPCs wurde genutzt, um die beitragenden Signalwege, die an der CPC-EV-vermittelten Zellaktivierung beteiligt sind, weiter zu untersuchen.

ein repräsentatives NTA-Diagramm, das die Größenverteilung und Partikelkonzentration von Elektrofahrzeugen zeigt, die aus dem gleichen Volumen an durch Vehikel (0,0125 % DMSO; Veh-EVs) oder Kalziumionophor (Ca-Ionen-EVs) stimulierten CPCs isoliert wurden. b Repräsentative TEM-Bilder von Fahrzeug- und Ca-Ionen-Elektrofahrzeugen. (c) Western-Blot-Analyse, die das Vorhandensein von CD81, CD9, ALIX, β-Actin (β-ACT) und das Fehlen von Calnexin (CNX) in Fahrzeug- und Ca-Ionen-EVs zeigt. β-ACT und CNX waren im CPC-Lysat (CL) vorhanden. d Proteingehalt pro 1 × 1010 Fahrzeug- und Ca-Ionen-EVs von drei biologischen Triplikaten. e–h Repräsentative Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem AKT (pAKT), Gesamt-AKT (tAKT), phosphoryliertem ERK1/2 (pERK1/2) und Gesamt-ERK1/2 (tERK1/2) in HMEC-1, behandelt mit Veh- und Ca-Ionen -EVs normalisiert auf zwei Dosen von (e, f) EV-Partikelzahlen oder (g, h) EV-Gesamtproteingehalt. β-ACT wurde als Haushaltsprotein einbezogen. f, h Quantifizierung der pAKT-, tAKT-, pERK1/2- und tERK1/2-Expressionsniveaus mittels Densitometrie, ausgedrückt als pAKT/AKT- und pERK/ERK-Verhältnisse (n = 4 und n = 3). Biologische Replikate von (e, g) sind auch in der ergänzenden Abbildung 9a – c dargestellt. i Wundheilungstest, der die Auswirkungen von 2 × 1010 oder 1 µg Fahrzeug- und Ca-Ionen-EVs auf die HMEC-1-Migration zeigt (n = 3). j Sprouting-Assay, der die durch Fahrzeuge und Ca-Ionen-EV induzierte HMEC-1-Sprossenbildung auf Perlen zeigt, analysiert sowohl als (k) mittlere Länge pro Spross als auch Gesamtlänge der Sprossen pro Perle (n = 3, technische Replikate. Die Daten sind repräsentativ für zwei biologisch unabhängige Experimente). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,033; **p < 0,0021, ***p < 0,0002.

Um Einblicke in den Mechanismus der CPC-EV-vermittelten Zellaktivierung zu erhalten, wurden die Signaltransduktionswege, die durch HMEC-1-Stimulation mit funktionellen Vehikel-, nicht-funktionalen Ca-Ionen-EVs und Negativkontrolle (PBS) ausgelöst werden, durch Phosphoproteomik charakterisiert (ergänzende Abb . 2). Beim Vergleich von veh-EV- mit PBS-behandelten HMEC-1-Zellen nach 30-minütiger Stimulation wurden signifikante Veränderungen speziell auf Phosphoproteomebene beobachtet, unabhängig von der Proteomregulation (Abb. 3a). Die Phosphoproteomanalysen waren hochempfindlich und identifizierten etwa 6900 Phosphosite der Klasse I (mit einer Lokalisierungswahrscheinlichkeit der Phosphomodifikation > 0,75) aus nur 50 µg HMEC-1-Lysaten. Die hierarchische Clusterbildung der sich signifikant verändernden Phosphosite ergab einen Cluster mit erhöhter Phosphorylierung in mit Fahrzeug-EV behandeltem HMEC-1 im Vergleich zu mit PBS und Ca-Ionen-EV behandeltem HMEC-1 (Abb. 3b, gestrichelter Cluster C1). Um besser zu verstehen, welche intrazellulären Signalwege durch Veh-EVs aktiviert wurden, wurden die im Cluster C1 (n = 195) vorhandenen Phosphosites weiter mit den PANTHER-Signalwegen verglichen. Die Insulin/IGF-Weg-MAPKK/MAPK-Kaskade sowie die Ras- und Interleukin-Signalwege wurden als die am stärksten angereicherten Wege in HMEC-1 identifiziert (Abb. 3c). Darüber hinaus umfassten signifikant veränderte Phosphosites zwischen Fahrzeug- und Ca-Ionen-EV-stimuliertem HMEC-1 Mitglieder der PI3K-AKT- und MAPK-Signalwege (hervorgehoben in Abb. 3d). Dies zeigt die spezifischen intrazellulären Wege, die an der CPC-EV-vermittelten HMEC-1-Aktivierung beteiligt sind.

a Vulkandiagramme, die Veränderungen im (i) Proteom und (ii) Phosphoproteom von HMEC-1 nach veh-EV-Stimulation im Vergleich zur Negativkontrolle (PBS) zeigen. Die P-Werte wurden mithilfe des Student-T-Tests berechnet und sich signifikant verändernde Proteine ​​(p-Wert ≤ 0,05 und fache Veränderung >2) in mit Veh-EV behandeltem HMEC-1 sind rot hervorgehoben, während sich signifikant verändernde Proteine ​​in PBS in hervorgehoben sind Blau. b Hierarchische Clusterbildung von 1549 sich signifikant verändernden Phosphosites (ANOVA, q-Wert ≤ 0,05), gefunden in HMEC-1 bei Stimulation mit Veh-EVs, Ca-Ionen-EVs und PBS. Cluster C1, einschließlich der durch Fahrzeug-EV induzierten spezifischen Phosphorylierung, ist durch gestrichelte Linien hervorgehoben. c PANTHER Pathway-Anreicherungsanalyse von Phosphoproteinen, die in Cluster C1 gefunden wurden, geordnet nach facher Anreicherung. *= FDR < 0,05, **= FDR < 0,01, ***= FDR < 0,005. d Vulkandiagramm, das fache Veränderungen im Phosphoproteom von HMEC-1 bei Veh-EV im Vergleich zur Ca-Ionen-EV-Stimulation zeigt, ebenfalls in Abb. 6a dargestellt. Die P-Werte wurden mithilfe des Student-T-Tests berechnet. Signifikant sich ändernde Phosphosite (p-Wert < 0,05 und fache Änderung > 2) nach der Behandlung mit Veh-EV sind rot hervorgehoben, während sich signifikant ändernde Phosphosite nach der Behandlung mit Ca-Ionen-EV in rot hervorgehoben sind Blau.

CPC-EVs induzieren die Aktivierung der intrazellulären Signalübertragung innerhalb von 30 Minuten nach der Verabreichung an HMEC-1 (Abb. 1e, 3a), was auf eine Rolle direkter Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen von EVs mit der Zielzellmembran schließen lässt. Um den Beitrag von EV-assoziierten Proteinen zur CPC-EV-Funktionalität zu bestimmen, wurden CPC-EV-Oberflächenproteine ​​und die extrazellulären Rezeptordomänen von Transmembranproteinen durch Behandlung mit 100 µg/ml Proteinase K entfernt. Anschließend wurden mit Proteinase K behandelte und unbehandelte EVs einer Behandlung unterzogen eine zweite SEC-Trennung, um freie Proteinfragmente aus Elektrofahrzeugen zu entfernen. Eine Verringerung des Proteingehalts in mit Proteinase K behandelten EVs wurde durch microBCA-Analyse bestätigt (Abb. 4a), und NTA zeigte, dass die EV-Größe durch die Proteinase K-Behandlung nicht beeinflusst wurde (Abb. 4b). Western-Blot-Analysen bestätigten die Entfernung des EV-Oberflächenproteins CD81 in mit Proteinase K behandelten EVs, während das intravesikuläre Protein Syntenin-1 davon nicht betroffen war (Abb. 4c). Mit Proteinase K behandelte EVs induzierten im Vergleich zu unbehandelten EVs weniger stark die Phosphorylierung von AKT in HMEC-1 (Abb. 4d, e, ergänzende Abb. 9d), was einen wesentlichen Beitrag von CPC-EV-assoziierten Proteinen zu HMEC-1 bestätigte. 1 Aktivierung.

a Proteingehalt pro 1 × 1010 EVs, behandelt mit (+) und ohne (-) Proteinase K (Prot K) aus zwei repräsentativen Experimenten. b Repräsentatives NTA-Diagramm, das die Größenverteilung und Partikelkonzentration beider EV-Populationen nach einer zweiten SEC-Isolierung zeigt. c Western-Blot-Analyse, die das Fehlen bzw. Vorhandensein von CD81 in mit Prot K behandelten (+) bzw. unbehandelten (-) EVs zeigt. Syntenin-1 (SYNT) und β-Actin (β-ACT) waren in beiden EV-Populationen vorhanden, während sie bei Calnexin (CNX) fehlten. β-ACT und CNX waren im CPC-Lysat (CL) vorhanden. d Repräsentative Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem AKT (pAKT) und Gesamt-AKT (tAKT) in HMEC-1, stimuliert mit Prot K- (+) und unbehandelten (-) CPC-EVs, normalisiert auf zwei Dosen von EV-Partikelzahlen. e Quantifizierung von pAKT und tAKT, Expressionsniveaus mittels Densitometrie, ausgedrückt als pAKT/AKT-Verhältnis (n = 3). Die biologische Nachbildung von (d) ist in der ergänzenden Abbildung 9d dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **p < 0,0021, ***p < 0,0002.

Als nächstes versuchten wir, die CPC-EV-Proteine ​​zu identifizieren, die an der Aktivierung der intrazellulären Signalübertragung und der HMEC-1-Migration beteiligt sind, indem wir die Unterschiede in der Funktionalität zwischen Veh-, Ca-Ionen- und SKOV-3-EVs nutzten. Die Identifizierung unterschiedlich exprimierter Proteine ​​zwischen funktionellen Veh-EVs und nicht-funktionalen Ca-Ionen-EVs, die von demselben CPC-Spender freigesetzt werden, eliminiert unterschiedlich exprimierte Proteine ​​aufgrund von Unterschieden im Zellspender, während SKOV-3-EVs als zusätzliche nicht-funktionale Nicht-Stamm-EVs einbezogen wurden Zellkontrolle. Mithilfe einer unvoreingenommenen, markierungsfreien Proteomikstrategie haben wir das gesamte EV-Proteom zwischen den drei Quellen quantitativ verglichen. Daraus wurden 2077 Proteine ​​unter allen EV-Populationen sicher identifiziert (1 % FDR). Von diesen wurden 1293 Proteine ​​in mindestens 2 der 3 biologischen Replikate für jede EV-Population nachgewiesen (Abb. 5a), von denen wir die 209 Proteine ​​weiter untersuchten, die zwischen Veh-EVs und Ca-Ionen-EVs signifikant verändert waren (Abb . 5b, i) und 146 Proteine ​​zwischen veh-EVs und SKOV-3-EVs (Abb. 5b, ii). Die Anreicherung von PAPP-A, Tumornekrosefaktor-stimuliertem Gen-6 (TSG-6) und Laminin-Untereinheit Gamma 1 (LAMC1) in Veh-EVs im Vergleich zu Ca-Ionen-EVs wurde durch Western Blot validiert (Abb. 5c).

eine Wärmekarte der Proteinhäufigkeit (log2) der in jedem biologischen Replikat identifizierten Proteine ​​(Veh-, Ca-Ionen- und SKOV-3-EVs), identifiziert durch LC-MS/MS. b Vulkandiagramme, die durchschnittliche fache Änderungen der Proteinhäufigkeit (log2) der in Fahrzeug-EVs identifizierten Proteine ​​im Vergleich zu (i) Ca-Ionen-EVs und (ii) SKOV-3-EVs zeigen. Die P-Werte wurden mithilfe des Student-T-Tests berechnet, und sich signifikant verändernde Proteine ​​(p-Wert ≤ 0,05 und fache Änderung >2) in Fahrzeug-EVs sind rot hervorgehoben, während sich Proteine ​​in Ca-Ionen- und SKOV-3-EVs signifikant verändern werden blau hervorgehoben. c Western-Blot-Analyse, die die Anreicherung der MS-identifizierten Proteine ​​NID1, TSG-6, LAMC1, PAPP-A, CD81 und β-Actin (β-ACT) in Veh-EVs im Vergleich zu Ca-Ionen-EVs bestätigt. CNX war ausschließlich im CPC-Lysat (CL) vorhanden. Vollständige Blots von β-ACT, PAPP-A und NID1 sind in der ergänzenden Abbildung 10 dargestellt. d Venn-Diagramm, das die Anzahl der Proteine ​​mit einer > 2-fach signifikanten Anreicherung (p ≤ 0,05) in veh-EVs im Vergleich zu Ca-Ionen- und SKOV zeigt -3-EVs und Überschneidungen zwischen diesen beiden Populationen. e Genontologieanalyse mit PANTHER angereicherter biologischer Prozesse für die 105 überlappenden Proteine, Darstellung der Anzahl der identifizierten Proteine ​​in jeder Gruppe, geordnet nach dem kleinsten korrigierten p-Wert (−log10(FDR)).

Eine weitere Analyse der signifikant angereicherten Proteine ​​in Fahrzeug-EVs ergab, dass 105 Proteine ​​im Vergleich zu den Ca-Ionen- und SKOV-3-EV-Populationen durchweg an Fahrzeug-EVs angereichert waren (Top 20 in der Ergänzungstabelle 2), während 104 und 41 Proteine ​​angereichert waren ausschließlich im Vergleich zu Ca-Ionen-EVs bzw. SKOV-3-EVs (Abb. 5d). Die vollständige Liste der mit Veh-EV angereicherten Proteine ​​(n = 105) wurde von Gene Ontology weiter mit Anmerkungen versehen, die eine Überrepräsentation biologischer Prozesse wie „biologische Adhäsion“, „Zelladhäsion“ und „Regulierung der Zellmigration“ ergaben (Abb . 5e). Zusammengenommen bestätigen diese, dass die beobachteten Auswirkungen von CPC-EVs auf Endothelzellen möglicherweise durch eine kollektive Untergruppe von EV-Proteinen vermittelt werden, die die Migration von Endothelzellen fördern.

Im Anschluss an die grobere Analyse des CPC-EV-Proteoms untersuchten wir den Beitrag einzelner Proteine ​​zur CPC-EV-Funktionalität. Die MS-Proteomanalyse identifizierte PAPP-A und NID1, Proteine, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie zu Mechanismen der Herzreparatur beitragen7,27, und gehören zu den 20 am stärksten angereicherten Proteinen in veh-EVs im Vergleich zu Ca-Ionen- und SKOV-3-EVs (Abb. 5b). , Ergänzende Abb. 4a, Ergänzende Tabelle 2). Ein vorgeschlagener Mechanismus der PAPP-A-Funktion besteht in seiner Expression auf der EV-Oberfläche durch Bindung an Glykosaminoglykane auf der EV-Membran (Abb. 6a)7. Durch die Abspaltung von IGFBP4 vom IGF-1/IGFBP4-Komplex induziert es die Freisetzung von IGF-1 im extrazellulären Raum und die anschließende Aktivierung der intrazellulären Signalübertragung durch Bindung an IGF-R28. Die Phosphoproteomanalyse in HMEC-1 nach Veh-EV-Stimulation ergab tatsächlich die spezifische Aktivierung der Insulin/IGF-Signalweg-MAPKK/MAPK-Kaskade (Abb. 3c) und identifizierte die Phosphorylierung von Mitgliedern der MAPK- und AKT-mTOR-Signalkaskaden, einschließlich IRS2 , RAF1, MEK2, AKT und mTOR (Abb. 6a). Um den Beitrag des IGF-Rezeptors (IGF-R) zur intrazellulären Signalübertragung bei EV-Stimulation zu untersuchen, verwendeten wir den IGF-R-Inhibitor Picropodophyllin (PPP). PPP hob dosisabhängig den Anstieg der ERK1/2- und AKT-Phosphorylierung in HMEC-1 bei CPC-EV-Stimulation auf (Abb. 6b, ergänzende Abb. 9g, h), was einen Beitrag des IGF-R-Signalwegs in HMEC-1 zeigt Aktivierung. NID1 ist ein Glykoprotein, das in der Basalmembran vorhanden ist und Berichten zufolge die Zellmigration fördert, indem es auf EVs vorhanden ist, die aus hepatozellulären Karzinomzellen stammen29. Interessanterweise bestätigte das Western Blot die NID1-Expression in Fahrzeug-EVs, zeigte aber auch das Vorhandensein einer NID1-Form mit höherem Molekulargewicht in Ca-Ionen-EVs (Abb. 5c). Dies könnte auf Unterschiede im NID1-Glykosylierungsstatus und die Tendenz zur Erkennung nicht glykosylierter Peptide durch unsere MS-Analyse zurückzuführen sein.

ein Schema, das den hypothetischen Mechanismus der (intra)zellulären Signalübertragung darstellt, die durch EV-assoziiertes PAPP-A aktiviert wird, basierend auf identifizierten Proteinen und signifikant veränderten Phosphosites, die in HMEC-1 nach Veh-EV-Stimulation durch (Phosphor-)Proteomanalyse gemessen wurden. Erkannte Proteine ​​in HMEC-1 werden in Grau dargestellt, während sich signifikant verändernde Phosphosite im Cluster C1 (siehe Abb. 3d) in Braun dargestellt werden. b Repräsentative Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem AKT (pAKT), Gesamt-AKT (tAKT), phosphoryliertem ERK1/2 (pERK1/2) und Gesamt-ERK1/2 (tERK1/2) in HMEC-1, behandelt mit 6 × 1010 oder 2 × 1010 CPC-EVs oder mit 200 ng/ml freiem IGF-1 nach Vorinkubation mit unterschiedlichen Dosen Picropodophyllin (PPP). β-Actin (β-ACT) wurde als Haushaltsprotein einbezogen (I = phosphorylierter Protein-Blot, II = Gesamtprotein-Blot). Biologische Replikate von (b) sind in der ergänzenden Abbildung 9g, h dargestellt. c Sanger-Sequenzierungsergebnisse bestätigen die 1-bp-Insertion in Exon 3 von PAPPA an der CRISPR/Cas9-Zielstelle des PAPPA KO-CPC-Klons im Vergleich zur polyklonalen NTgRNA-CPC-Linie. d Western-Blot-Analyse, die das Fehlen von PAPP-A in PAPPA-KO-EVs im Vergleich zu NTgRNA-EVs zeigt; das Vorhandensein von CD81, CD63, Syntenin-1 (SYNT), Flotillin (FLOT1), β-ACT und das Fehlen von Calnexin (CNX) in beiden EV-Populationen. FLOT1, β-ACT und CNX waren im CPC-Lysat (CL) vorhanden. e Repräsentatives NTA-Diagramm, das die Größenverteilung und Partikelkonzentration von PAPPA KO- und NTgRNA-CPC-EVs zeigt. f Proteingehalt pro 1 × 1010 PAPPA KO- und NTgRNA-EVs von zwei repräsentativen Experimenten.

Um den Einfluss von PAPP-A und NID1 auf die EV-vermittelte Endothelzellaktivierung zu untersuchen, wurde die CRISPR/Cas9-Technologie eingesetzt, um PAPP-A und NID1 in CPCs auszuschalten (KO). Drei verschiedene gRNAs, die auf Exon 3 und 4 von PAPPA sowie auf die 5'UTR-Region und Exon 1 von NID1 abzielen, wurden ausgewählt, um die am besten geeignete Zielstelle in PAPPA bzw. NID1 für die Genbearbeitung zu identifizieren, und ihre genomische DNA-Spaltungseffizienz wurde mithilfe von bestimmt der T7-Endonuklease-Assay (Ergänzende Abbildungen 4b, 5a). Basierend auf der höchsten Effizienz der DNA-Spaltung haben wir gRNA 1 und 2 für PAPP-A und gRNA 3 für NID1 für die Erzeugung von KO-CPC-Linien ausgewählt. Die Sanger-Sequenzierung ergab eine gemischte Population mutierter Allele an den gRNA-Zielstellen (Ergänzende Abbildungen 4c, 5b). Aus diesen CPC-KO-Linien wurden durch klonale Expansion einzelne Klone erzeugt und das Vorhandensein homozygoter biallelischer Deletionen oder Insertionen wurde durch Sanger-Sequenzierung bestimmt (Ergänzende Abbildungen 4d, 5c). Ein CPC-Klon mit einer homozygoten Insertion von 1 bp in PAPPA und ein Klon mit einer Deletion von 8 bp in NID1 wurden anschließend für die Isolierung von PAPP-A-depletierten (PAPPA KO) und NID1-depletierten (NID KO) EVs ausgewählt und verwendet für weitere Funktionsstudien (Abb. 6c, ergänzende Abb. 5d). Als normale CPC-EV-Kontrolle dienten eine polyklonale CPC-Linie, die mit der CRISPR/Cas9-Maschinerie transduziert wurde, und eine nicht zielgerichtete gRNA (NTgRNA). Die PAPP-A-Depletion in isolierten PAPPA KO-EVs wurde durch Western Blot bestätigt (Abb. 6d). Die PAPP-A-Depletion führte zu einem verringerten Zellwachstum, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Zellmorphologie (ergänzende Abbildung 4e, f). Die durch Western Blot bestimmte EV-Produktion ergab ähnliche Mengen an CD81, Syntenin-1, Flotillin und β-Actin in beiden PAPPA KO- und NTgRNA-EVs (Abb. 6d). Die Expression von CD63 schien in den PAPPA KO-EVs leicht reduziert zu sein. Beide EV-Populationen hatten eine ähnliche Größe, wie durch NTA bestimmt (Abb. 6e), und eine ähnliche Reinheit (µg Protein/1 × 1010 EVs) (Abb. 6f). Obwohl NID1-KO-CPCs im Vergleich zu NTgRNA-CPCs ebenfalls eine etwas langsamere Wachstumsrate aufwiesen (ergänzende Abbildung 5e) und eine etwas längere Morphologie aufwiesen (ergänzende Abbildung 5f), wurde die EV-Freisetzung nicht beeinflusst, wie durch NTA und die Expression bestimmt der EV-Marker CD81, Syntenin-1 und der β-Actin-Spiegel (ergänzende Abbildung 5g, h). NID1-KO-EVs enthielten eine etwas höhere Proteinmenge pro Partikel (µg Protein/1 × 1010 EVs) (ergänzende Abbildung 5i).

Als nächstes untersuchten wir den Einfluss von PAPP-A und NID1 KO auf die EV-induzierte Angiogenese. Im Vergleich zu NTgRNA-EVs waren PAPPA-KO-EVs bei der Induktion der AKT-Phosphorylierung in HMEC-1 weniger bioaktiv, wenn die EV-Zugabe auf die Gesamtpartikelzahl oder den Gesamtproteingehalt normalisiert wurde (Abb. 7a – d, ergänzende Abb. 9i – k). . Darüber hinaus wurde ein Trend zu einer verringerten ERK1/2-Phosphorylierung beobachtet. NID1 KO hatte keinen Einfluss auf die EV-stimulierende Aktivität (ergänzende Abbildung 6a – d). In einem HMEC-1-Scratch-Assay waren PAPPA-KO-EVs auch weniger wirksam bei der Induktion des Wundverschlusses, berechnet sowohl als prozentualer Wundverschluss als auch als absolute Migrationsstrecke, wenn sie auf die Gesamtpartikelzahl oder den Gesamtproteingehalt normiert wurden (Abb. 7e). Darüber hinaus verloren PAPPA KO-EVs einen Teil ihrer Fähigkeit, die Bildung von Sprossen in einem In-vitro-Sprossentest zu induzieren (Abb. 7f, g). Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied in der Aktivität zwischen NID1-KO- und NTgRNA-EVs bei der Induktion des Wundverschlusses (ergänzende Abbildung 6e). Es wurde angenommen, dass NID1 an der Herzreparatur beteiligt ist, indem es an den αVβ-Integrinrezeptor bindet und dadurch die nachgeschaltete MAPK-Signalübertragung aktiviert27. Die EV-induzierte AKT- und ERK1/2-Phosphorylierung und der Wundverschluss wurden jedoch durch die Vorbehandlung mit einem IntegrinαVβ3-Antikörper nicht beeinflusst (ergänzende Abbildung 7a – d). Darüber hinaus induzierte rekombinantes NID1 weder AKT- und ERK1/2-Phosphorylierung noch konnte es im HMEC-1-Scratch-Assay einen Wundverschluss induzieren. Dies impliziert, dass EV-assoziiertes NID1 in unseren In-vitro-Tests nicht zur CPC-EV-Funktionalität beiträgt. Insgesamt legen unsere Daten nahe, dass PAPP-A an CPC-EVs angereichert ist und über den IGF-R-Signalweg an der EV-vermittelten Aktivierung von Endothelzellen beteiligt ist.

a–d Repräsentative Western-Blot-Analysen von pAKT, tAKT, pERK1/2 und tERK1/2 in HMEC-1, behandelt mit PAPPA KO- und NTgRNA-EVs, normalisiert auf zwei Dosen der Gesamtpartikelzahl a, b oder des Gesamtproteingehalts c, d . β-ACT wurde als Haushaltsprotein einbezogen. b, d Quantifizierung der pAKT-, tAKT-, pERK1/2- und tERK1/2-Expressionsniveaus mittels Densitometrie, ausgedrückt als pAKT/AKT- und pERK/ERK-Verhältnisse (n = 3). Biologische Replikate von (a, c) sind auch in der ergänzenden Abbildung 9i – k dargestellt. e Wundheilungstest, der die Auswirkungen von 1 µg und 2 × 1010 NTgRNA- und PAPPA-KO-EVs auf die HMEC-1-Migration zeigt, analysiert sowohl als % Wundverschluss als auch als absolute Migrationsstrecke (n = 3, technische Replikate). Die Daten sind biologisch repräsentativ für drei unabhängige Experimente). f, g Keimtest, der NTgRNA- und PAPPA KO-EV-induzierte HMEC-1-Sprossenbildung auf Perlen zeigt, analysiert sowohl als (g) mittlere Länge pro Spross als auch Gesamtsprossenlänge pro Perle (n = 3, technische Replikate. Die Daten sind repräsentativ von zwei biologisch unabhängigen Experimenten). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,033, **p < 0,0021, ***p < 0,0002.

SEC ist eine weit verbreitete Methode zur EV-Isolierung, liefert jedoch keine vollständig reine EV-Population, da auch ein kleiner Anteil löslicher Proteine ​​koisoliert werden kann. Da ein möglicher Beitrag dieser co-isolierten Proteine ​​zur EV-Funktion postuliert wurde, haben wir uns vorgenommen, den Beitrag dieser co-isolierten Proteine ​​zur Funktionalität von SEC-isolierten CPC-EV-Präparaten zu untersuchen. Wir haben tatsächlich die Anreicherung von ECM-Proteinen in Fahrzeug-EVs bestätigt (Ergänzungstabelle 2) und versucht herauszufinden, ob diese Proteine ​​in Elektrofahrzeugen verpackt oder in unseren Präparaten co-isoliert waren. Zu diesem Zweck wurde die OptiprepTM-Dichtegradientenzentrifugation nach SEC eingesetzt, um EVs weiter von co-isolierten Proteinen zu trennen (Abb. 8a). Die Western-Blot-Analyse der verschiedenen Fraktionen bestätigte das Vorhandensein der EV-Marker CD81, Syntenin-1 und CD63 hauptsächlich in den Fraktionen 2–4 (Abb. 8b). Die Gesamtpartikelzahl in jeder Fraktion wurde mit NTA gemessen und zeigte das Vorhandensein von Partikeln in den Fraktionen 2–4, obwohl Partikel auch in der oberen Fraktion (F1) vorhanden waren (Abb. 8b). Die EV-haltigen Fraktionen 1–5 (Opti-EVs) und die co-isolierten proteinhaltigen Fraktionen 7 und 8 (Opti-Protein), wie durch Silberfärbung gezeigt (ergänzende Abbildung 3a), wurden gesammelt und unter Verwendung von 100 oder 10 konzentriert kDa-Cut-off-Spinfilter. Opti-EVs und SEC-EVs zeigten eine ähnliche Größenverteilung (Abb. 8c), während Opti-EVs im Vergleich zu SEC-EVs einen geringeren Proteingehalt pro Partikel enthielten, was erwartungsgemäß auf eine höhere Reinheit schließen lässt (Abb. 8d). Western Blot zeigte eine erhöhte relative Expression von CD81 und Syntenin-1 sowie das Fehlen von Calnexin in Opti-EVs im Vergleich zu SEC-EVs, was wiederum eine höhere Reinheit bestätigt (Abb. 8e). TEM bestätigte das Vorhandensein von membranumschlossenen Partikeln in beiden EV-Präparaten (Abb. 8f). Da wir herausfanden, dass Iodixanol die Bioaktivität von EVs erhöhte, um die AKT- und ERK1/2-Phosphorylierung und den Wundverschluss zu induzieren (ergänzende Abbildung 3b, c), wurden die Iodixanolkonzentrationen in allen Proben in allen Funktionstests konstant gehalten (2%), um die direkte Wirkung auszuschließen funktionelle Wirkung von Iodixanol. In einem Endothelaktivierungstest induzierten Opti-EVs die AKT- und ERK1/2-Phosphorylierung, wenn auch in geringerem Ausmaß als SEC-EVs (Abb. 8g, h, ergänzende Abb. 9e, f). Die Opti-Protein-Fraktion zeigte auch eine begrenzte HMEC-1-stimulierende Kapazität. In einem HMEC-1-Scratch-Assay zeigten sowohl Opti-EVs als auch die Opti-Proteinfraktion im Vergleich zu SEC-EVs einige, aber geringere migrationsstimulierende Kapazitäten (Abb. 8i). Um die Assoziation von PAPP-A mit CPC-EVs zu untersuchen, untersuchten wir die Expression von PAPP-A in den verschiedenen Fraktionen nach Iodixanol-Gradientenisolierung. Western Blot zeigte, dass PAPP-A sowohl in den Tetraspanin-positiven als auch in den negativen Fraktionen 4–7 vorhanden war (ergänzende Abbildung 8). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass sowohl EV-assoziierte als auch co-isolierte Proteine, die in den rohen SEC-EV-Präparaten vorhanden sind, zur Endothelzellaktivierung beitragen können.

eine schematische Übersicht über das EV-Isolierungsprotokoll, um reine Opti-EVs zu erhalten. SEC-EVs wurden in den Boden eines diskontinuierlichen OptiprepTM-Gradienten geladen und 16 Stunden lang ultrazentrifugiert. b Die resultierenden Fraktionen (F1–8) wurden mittels NTA (oberes Feld) auf Partikelanzahl und mittels Western Blot auf das Vorhandensein der EV-Markerproteine ​​CD81, CD63 und Syntenin-1 (SYNT) analysiert. Von jeder Probe wurden gleiche Volumina analysiert. Die Iodixanolkonzentration wurde in jeder Fraktion gemessen (unteres Feld). Die Fraktionen 1–5 wurden gepoolt und konzentriert (Opti-EVs). c Repräsentatives NTA-Diagramm, das die Größenverteilung und Partikelkonzentration von SEC- und gereinigten Opti-EVs zeigt. d Proteingehalt pro 1 × 1010 SEC- und Opti-EVs von drei repräsentativen Experimenten. e Western-Blot-Analyse zeigt das Vorhandensein von CD81, SYNT, β-Actin (β-ACT) in gereinigten Opti-EV- und Proteinfraktionen im Vergleich zu rohen SEC-EVs. Calnexin (CNX) war nur im CPC-Lysat (CL) vorhanden. Der vollständige β-ACT-Blot ist in der ergänzenden Abbildung 10 dargestellt. f Repräsentatives TEM-Bild von SEC- und Opti-EVs. g, h Repräsentative Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem AKT (pAKT), Gesamt-AKT (tAKT), phosphoryliertem ERK1/2 (pERK1/2) und Gesamt-ERK1/2 (tERK1/2) in HMEC-1, behandelt mit SEC-EVs und Opti -EVs normalisiert auf die Gesamtpartikelzahl und mit SEC-EVs, Opti-EVs und Opti-Protein-Fraktion normalisiert auf den Gesamtproteingehalt. β-ACT wurde als Haushaltsprotein einbezogen (I = phosphorylierter Protein-Blot, II = Gesamtprotein-Blot). h Quantifizierung der pAKT-, tAKT-, pERK1/2- und tERK1/2-Expressionsniveaus mittels Densitometrie, ausgedrückt als pAKT/AKT- und pERK/ERK-Verhältnisse (n = 3). Biologische Replikate von (g) sind in der ergänzenden Abbildung 9e, f dargestellt. i Wundheilungsexperiment, das die Auswirkungen von SEC- und Opti-EVs auf die HMEC-1-Migration zeigt, normalisiert sowohl auf die Gesamtpartikelzahl als auch auf den Gesamtproteingehalt, analysiert sowohl als % Wundverschluss als auch als absolute Migrationsstrecke. Die Zugabe der Opti-Protein-Fraktion wurde auf das Volumen normalisiert (n = 3, technische Replikate. Die Daten sind repräsentativ für drei biologisch unabhängige Experimente). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,033.

In mehreren präklinischen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung von CPC-EV die Herzfunktion verbessert, indem es verschiedene zelluläre Prozesse einschließlich der Angiogenese fördert1. Im Einklang mit früheren Studien haben wir bestätigt, dass CPC-EVs aktive Induktoren der Aktivierung und Funktionalität von Endothelzellen sind5,6. Trotz vielversprechender präklinischer Ergebnisse von EV-Therapeutika zur Geweberegeneration wird die Umsetzung in die Klinik immer noch durch die In-vivo-Reproduzierbarkeit aufgrund der EV-Heterogenität und des schlechten Verständnisses funktioneller Mediatoren in EVs behindert10,11. Um CPC-EVs als Therapeutika voranzutreiben, sind weitere Einblicke in die funktionelle EV-Fracht und die Mechanismen der EV-vermittelten Zellaktivierung erforderlich. In dieser Arbeit untersuchten wir die proangiogene Zusammensetzung von CPC-EVs.

Um die Freisetzung von Elektrofahrzeugen durch CPCs zu erhöhen, untersuchten wir die Verwendung von Calciumionophor A23187, einer Verbindung, die die Freisetzung von Elektrofahrzeugen durch die Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Spiegel stimuliert23,24,25,26. Interessanterweise erhöhte die CPC-Exposition gegenüber Calciumionophor die EV-Freisetzung nicht, führte jedoch zu einer weniger funktionellen EV-Population, wie in verschiedenen HMEC-1-Angiogenese-Assays gezeigt wurde. Wir nutzten die Unterschiede in der Funktionalität zwischen CPC-Veh- und Ca-Ionen-EVs, um die spezifische Aktivierung der intrazellulären Signalübertragung mithilfe einer phosphoproteomischen Analyse von HMEC-1 bei Stimulation mit beiden EV-Populationen zu untersuchen. Dies ist eine der ersten Studien, die die Aktivierung der intrazellulären Signalübertragung in Empfängerzellen mittels Phosphoproteomik bei EV-Stimulation untersucht und dabei die erhöhte Phosphorylierung von Mitgliedern der P13K-AKT- und (Insulin/IGF-) MAPK-Signalwege identifizieren konnte. Wir beobachteten innerhalb von 30 Minuten nach der HMEC-1-Stimulation signifikante Veränderungen auf der Ebene des Phosphoproteoms, jedoch nicht auf der Ebene des Proteoms. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Fähigkeit von EVs, intrazelluläre Signalwege zu aktivieren, nach der Entfernung von EV-Oberflächenproteinen mithilfe von Proteinase K verloren ging, wie zuvor für EVs aus anderen Quellen gezeigt30. Dies deutet auf eine schnelle Signalübertragung über Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen statt auf die Bereitstellung von EV-Inhalten durch EV-Internalisierung hin. Tatsächlich zeigen neuere Studien, dass Elektrofahrzeuge nur eine sehr begrenzte Anzahl spezifischer miRNAs enthalten31,32,33,34,35, was die Bedeutung der Untersuchung des Beitrags anderer EV-Inhalte wie Proteine ​​zur EV-Funktionalität untermauert.

Mehrere Gruppen haben zuvor die proteomische Zusammensetzung von aus Stamm- und Vorläuferzellen stammenden Elektrofahrzeugen charakterisiert, die derzeit über mehrere Datenbanken verfügbar ist36,37,38. Die Identifizierung funktioneller Komponenten erfolgte jedoch hauptsächlich durch Vergleiche von Elektrofahrzeugen, die aus verschiedenen Zelltypen stammten7,39 oder nach Unterschieden bei der Zellvorkonditionierung40,41. Hier verglichen wir die proteomische Zusammensetzung funktionell unterschiedlicher EV-Typen, die von demselben Zelltyp und Spender freigesetzt wurden, und eliminierten dadurch mögliche Unterschiede im Inhalt, die durch Unterschiede in der Isolationstechnik und der biologischen Variabilität von Zelltyp und Spender verursacht werden. MS-Profiling identifizierte eine Vielzahl von Proteinen, die in Veh-EVs im Vergleich zu Ca-Ionen-EVs unterschiedlich exprimiert werden. Diese mit Veh-EV angereicherten Proteine ​​waren im biologischen Prozess der „Regulierung der Zellmigration“ der PANTHER-Genontologie überrepräsentiert (Top 3), was unseren Ansatz als Methode zur unvoreingenommenen Identifizierung von Proteinen unter Beweis stellte, die möglicherweise an der EV-induzierten Zellmigration beteiligt sind.

Die MS-Proteomanalyse identifizierte die mit CPC-EVs angereicherten Kandidatenproteine ​​PAPP-A und NID1. Mithilfe von CRISPR/Cas9 wollten wir ihren Beitrag zur EV-Funktion ermitteln. KO von NID1 hatte keinen Einfluss auf die HMEC-1-Stimulationskapazitäten von CPC-EVs. Im Gegensatz dazu führte die Abreicherung von PAPP-A aus CPC-EVs zu EVs mit verringerter Fähigkeit, In-vitro-Angiogenese zu induzieren. Das Vorhandensein von PAPP-A auf CPC-EVs und seine Beteiligung an der Kardioprotektion wurden zuvor von Barile et al.7 nachgewiesen. PAPP-A war auf der Oberfläche von CPC-abgeleiteten EVs vorhanden und hob den EV-vermittelten Schutz vor Staurosporin-induziertem Zelltod in HL-1-Zellen auf. Da ein Schutzverlust erst nach Zugabe des IGF-1/IGFBP4-Komplexes hervorgerufen wurde, wird angenommen, dass EV-gebundenes PAPP-A den IGF-1/IGFBP4-Komplex spaltet und dadurch zur IGF-1-Freisetzung und anschließenden Zielzellaktivierung führt28. Basierend auf gemessenen Veränderungen auf der Ebene des Phosphoproteoms konnten wir den Insulin/IGF-MAPK-Weg als den am stärksten angereicherten Weg identifizieren, was einen weiteren Zusammenhang zwischen PAPP-A und der Aktivierung der IGF-1-MAPK-Signalübertragung darstellt. Dies wird weiter durch unsere Beobachtung gestützt, dass der IGF-R-Inhibitor PPP die CPC-EV-induzierte HMEC-1-Aktivierung aufhob.

Es wurde berichtet, dass aus verschiedenen Stammzelltypen freigesetzte Elektrofahrzeuge in vitro und in vivo ähnliche proregenerative Eigenschaften aufweisen42, es wurden jedoch auch Unterschiede in der Funktionalität zwischen verschiedenen Organen und Krankheitszuständen entdeckt, was sich in Unterschieden bei der identifizierten funktionellen Ladung von Elektrofahrzeugen widerspiegelt9,10. Von verschiedenen (Stamm-)Zellspendern stammende Elektrofahrzeuge können mit unterschiedlicher funktioneller proteomischer Fracht angereichert sein, da über das Vorhandensein von PAPP-A und NID1 in Elektrofahrzeugen bereits berichtet wurde38,43, jedoch nicht reproduzierbar44. Die proteomischen Profile verschiedener aus Stammzellen gewonnener EVs können sich aufgrund der EV-Heterogenität, die durch unterschiedliche Methoden zur EV-Isolierung verursacht wird, stark unterscheiden, da SEC beispielsweise im Vergleich zu anderen Techniken wahrscheinlich überschüssige lösliche Proteine ​​besser entfernt13, aber auch aufgrund der Variabilität zwischen Zellen Spender und Kulturstaat2. Hier untersuchten wir den Beitrag einzelner CPC-EV-assoziierter Proteine ​​zur Stimulierung proangiogener Prozesse in vitro, die eindeutig zu allen proregenerativen Eigenschaften von (CPC-)EVs in vivo beitragen, diese aber möglicherweise nicht erklären. Ob PAPP-A in anderen Zusammenhängen zu den regenerativen Eigenschaften von Elektrofahrzeugen beiträgt, muss noch untersucht werden.

Obwohl in ersten Studien EVs als funktionelle Komponenten des Stammzellsekretoms identifiziert wurden, haben neuere Studien die Hypothese aufgestellt, dass auch lösliche co-isolierte Faktoren zu den beobachteten EV-vermittelten therapeutischen Wirkungen beitragen, die sogar synergistisch sein könnten14,15,16,17,18. Diese Beobachtungen legen nahe, dass freigesetzte therapeutische Reize wahrscheinlich nicht ausschließlich durch aus Stammzellen gewonnene EVs vermittelt werden. Wir beobachteten, dass viele der identifizierten Proteine, die in Fahrzeug-EVs angereichert waren, bekannte Bestandteile der ECM waren. Dies warf die Frage auf, ob diese Proteine ​​tatsächlich mit EVs assoziiert waren oder nur als Ergebnis der Co-Isolierung vorhanden waren. Obwohl andere Studien den Mitgliedern der ECM eine EV-vermittelte Funktion zugeschrieben haben, indem sie in EV-Präparaten vorhanden waren7,29,44, wurde der Einfluss von co-isolierten Proteinen in funktionellen CPC-EV-Präparaten, die durch SEC isoliert wurden, noch nicht untersucht. Hier zeigen wir, dass trotz SEC-Isolierung, die CPC-EVs aufgrund von Größenunterschieden von Proteinen trennt, das EV-Präparat immer noch co-isolierte Proteine ​​oder andere Faktoren enthält, die zur EV-Funktion beitragen. Tatsächlich zeigten sowohl co-isolierte Faktoren als auch die weiter gereinigten EVs nach der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation einige proangiogene Eigenschaften, wie auch von anderen nachgewiesen wurde45,46,47,48,49. Wir gehen davon aus, dass sowohl EV-assoziierte Faktoren als auch co-isolierte Proteine ​​einen Beitrag zur CPC-EV-Funktion leisten, der potenziell synergistisch sein könnte. Um weitere Einblicke in das Vorhandensein von PAPP-A in unseren CPC-EV-Präparaten zu erhalten, haben wir das Vorhandensein von PAPP-A in den verschiedenen Fraktionen nach der Iodixanol-Gradiententrennung untersucht. Wir beobachteten sein Vorkommen sowohl in Fraktionen, in denen auch Tetraspanine nachgewiesen wurden, als auch in Fraktionen mit höherer Dichte, was darauf hindeutet, dass PAPP-A mit Tetraspanin-positiven EVs, aber auch mit Tetraspanin-negativen EVs assoziiert sein könnte. Alternativ können die Glykosaminoglykanbindungen, durch die PAPP-A an die EV-Membran gebunden ist, während der Iodixanol-Gradientendichtezentrifugation zerstört werden, was zur Entfernung von PAPP-A aus der EV-Proteinkorona während des EV-Isolierungsprozesses führt. Es sollten jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Zusammensetzung und den Beitrag einer Proteinkorona zur CPC-EV-Funktion zu bestimmen, einschließlich der Anwesenheit spezifischer Kandidatenproteine ​​wie PAPP-A.

Zusammenfassend zeigen wir, dass CPC-EVs die Aktivierung von Endothelzellen und die Zellmigration fördern können, und identifizierten die proteomische Zusammensetzung funktioneller CPC-EVs, die möglicherweise zu diesen Prozessen beitragen. Darüber hinaus haben wir die Downstream-Signalisierung bei CPC-EV-Stimulation in Endothelzellen charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass sowohl EV-assoziierte Faktoren als auch co-isolierte Proteine ​​im CPC-EV-Präparat zur Endothelzellaktivierung beigetragen haben. Mithilfe von CRISPR/Cas9, um einzelne Proteine ​​aus EVs auszuschalten, identifizierten wir PAPP-A, nicht jedoch NID1, das zur CPC-EV-Funktion beiträgt. Diese Ergebnisse stützen die Idee, dass spezifische Proteine, die in SEC-EV-Präparaten vorhanden sind, selektiv spezifische Signale in Empfängerzellen induzieren können, um Prozesse wie die Angiogenese zu regulieren. Dieses Wissen über die proangiogenen Komponenten und die Lokalisierung dieser Komponenten in CPC-EV-Präparaten kann in zukünftigen Studien, in denen die Verwendung von EVs für therapeutische Anwendungen untersucht wird, weiter genutzt werden.

Herzvorläuferzellen (CPCs, Spender HFH070809) wurden wie zuvor beschrieben aus menschlichen fetalen Herzen gewonnen50. Menschliches fötales Herzgewebe wurde mit individueller Genehmigung unter Verwendung einer standardmäßigen schriftlichen Einverständniserklärung und nach Genehmigung der Ethikkommission des Universitätsklinikums Leiden, Niederlande, gewonnen. Dies entspricht den in der Deklaration von Helsinki dargelegten Grundsätzen für die Verwendung von menschlichen Probanden oder Gewebe. Primäre CPCs (Passage 9–17) wurden in SP++-Medium (66 % M199-Medium (Gibco), 22 % EGM-2 (Lonza), 10 % fötales Rinderserum (FBS) (Life-Tech), 1 % Penicillin/Streptomycin kultiviert (P/S) (Invitrogen) und 1 % MEM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco)12. Menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1, ATCC) wurden in MCDB131-Medium (Invitrogen) kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % P/ S, 5 % L-Glutamin (Invitrogen), 50 nM Hydrocortison (Sigma) und 10 ng/ml rhEGF-1 (Peprotech/Invitrogen)51,52. CPCs und HMEC-1 wurden in mit 0,1 % Gelatine beschichteten Kolben kultiviert. Epithel SKOV-3-Eierstock-Adenokarzinomzellen (ATCC) und HEK293fT-Zellen wurden in DMEM (Gibco), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, kultiviert. Alle Zellen wurden bei 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert und bei 80–90 % passagiert. Konfluenz nach Verdauung mit 0,25 % Trypsin. CPC-EV-konditioniertes Medium wurde hergestellt, indem CPCs 3 Tage lang auf SP++-Medium kultiviert wurden, bis 80 % Konfluenz erreicht war, gefolgt von einer 24-stündigen Kultur auf basalem FBS- und Supplement-freiem M199-Medium, das 1 enthielt µM Calciumionophor A23187 (Sigma) oder Vehikel (0,0125 % DMSO). Für direkte Vergleichsexperimente wurden (Knock-out-)CPC-Klonlinien derselben Passage verwendet. SKOV-EV-konditioniertes Medium wurde durch Kultivierung von SKOV-3 bis zu einer Konfluenz von 80 % erhalten, gefolgt von einem 24-stündigen Ersatz des Mediums durch DMEM ohne jegliche Zusätze.

Das konditionierte Medium wurde nach 24 Stunden gesammelt, 15 Minuten lang bei 2000 × g zentrifugiert und 0,45 µm filtriert (0,45 µm aPES-Flaschenverschluss-Nalgene-Filter), um Zelltrümmer zu entfernen. Das konditionierte Medium wurde unter Verwendung von Amicon Ultra-15-Spinfiltern (Merck Millipore) mit einem Molekulargewichts-Cut-Off (MWCO) von 100 kDa oder durch Tangentialflussfiltration (TFF) unter Verwendung einer Minimate-TFF-Kapsel mit einem MWCO von 100 kDa konzentriert und anschließend auf eine geladen S400-Hochpräparationssäule (GE Healthcare) mit einem ÄKTA-Startsystem (GE Healthcare), das eine UV-280-nm-Durchflusszelle enthält. Fraktionen, die EVs enthielten, wurden gepoolt, unter Verwendung eines 0,45-µm-Spritzenfilters mit tensidfreier Celluloseacetatmembran (SCFA) (Corning) filtriert und erneut unter Verwendung eines 100-kDa-MWCO-Amicon-Ultra-15-Spinfilters (Merck Millipore) konzentriert. Elektrofahrzeuge wurden bis zur weiteren Verwendung maximal 2 Tage bei 4 °C gelagert.

Um reinere Elektrofahrzeuge zu erhalten, wurden SEC-EVs mithilfe einer Iodixanol-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation weiter gereinigt. Lösungen von 5 %, 10 %, 20 und 40 % Iodixanol wurden durch Mischen von PBS mit OptiPrepTM 60 % (w/v) wässriger Iodixanollösung hergestellt. Ein diskontinuierlicher Gradient wurde hergestellt, indem 3 ml jeder Lösung in einem oben offenen 14,5-ml-Polyallomerröhrchen (Beckman Coulter) übereinander geschichtet wurden. Die Elektrofahrzeuge wurden unten in die 40-prozentige Lösung geladen. Die Röhrchen wurden 16 Stunden lang bei 100.000 × g und 4 ° C zentrifugiert (SW 32.1 Ti-Rotor, Beckamn Coulter). Von oben nach unten wurden 8 Fraktionen zu je 1,5 ml gesammelt. Zur Bestimmung der Dichte wurde jede Fraktion gewichtsskaliert. Die Partikelkonzentration wurde mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestimmt. EV-haltige Fraktionen (Fraktionen 1–5) wurden gepoolt, mit PBS verdünnt und unter Verwendung von 100-kDa-MWCO-Amicon-Ultra-15- oder Ultra-4-Spinfiltern (Merck Millipore) konzentriert. Proteinhaltige Fraktionen (Fraktionen 7 und 8) wurden gepoolt, mit PBS verdünnt und unter Verwendung von 10-kDa-MWCO-Amicon-Ultra-15-Spinfiltern (Merck Millipore) konzentriert. Verbleibendes Iodixanol wurde durch Waschen mit >20 ml PBS entfernt und die vollständige Entfernung wurde mit einem optischen Eclipse-Brix-Handrefraktometer (Bellingham+Stanley) bestätigt.

EVs wurden in einer Endkonzentration von 100 µg/ml Proteinase K (Promega) 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Proteinase K wurde durch Verdünnen der EV-Probe auf 1 ml in mit Proteaseinhibitor (Roche) ergänztem PBS inaktiviert, und EVs wurden anschließend durch SEC unter Verwendung einer Sepharose CL-4B-Säule, die an ein ÄKTA-Startsystem (GE Healthcare) angeschlossen war, von fraktionierten Proteinen getrennt eine UV-280-nm-Durchflusszelle. Parallel dazu wurde eine EV-Probe ohne Behandlung mit Proteinase K, aber mit den anschließenden Isolierungs- und Aufkonzentrierungsschritten mitgenommen und diente als unbehandelte Kontrolle. EV-haltige Fraktionen wurden gepoolt und erneut unter Verwendung eines 100-kDa-MWCO-Amicon-Ultra-4-Spinfilters (Merck Millipore) konzentriert.

Die NTA wurde mit einem Nanosight NS500-System (Malvern Technologies) durchgeführt. Elektrofahrzeuge wurden in PBS verdünnt und drei Videos von 30 Sekunden mit einer Kamerastufe von 15 und einer Erkennungsschwelle von 5 aufgenommen. Größe und Partikelkonzentration wurden mit der Software Nanosight NTA 3.3 (Malvern Technologies) bestimmt. Das Partikeloberflächenpotential wurde durch Laser-Doppler-Elektrophorese auf einem Zetasizer Nano Z (Malvern Panalytical, Malvern, UK) gemessen. Die Proben wurden in 0,1-fachem DPBS verdünnt und die Probe wurde für 20 Läufe in dreifacher Ausfertigung gemessen.

Die Gesamtproteinkonzentrationen von EV-Proben wurden mit dem Pierce microBCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers nach Lyse in 1x RIPA-Puffer (Abcam) bestimmt. EV-Proteine ​​wurden mit Western Blot analysiert. Die Proben wurden mit NuPAGE-Probenpuffer (Thermo Fisher Scientific) und NuPAGE-Probenreduktionsmittel (Thermo Fisher Scientific) gemischt und 10 Minuten lang auf 90 °C erhitzt, um Proteine ​​zu reduzieren. Gleiche Proteinmengen wurden auf ein 4–12 %iges Bis-Tris-Polyacrylamidgel (Thermo Fisher Scientific) geladen und einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine ​​wurden auf Immobilon-FL-Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (Merck Millipore) geblottet, die anschließend mit 50 % v/v Odyssey Blocking Buffer (LI-COR Biosciences) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) blockiert wurden. Die Antikörper wurden in 50 % v/v Odyssey Blocking Buffer in TBS mit 0,1 % v/v Tween 20 (TBS-T) inkubiert. Als Primärantikörper wurden Maus-Anti-CD63 (Abcam, 1:1000), Kaninchen-Anti-CD9 (Abcam, 1:1000), Maus-Anti-ALIX (Thermo Scientific, MA1-83977) und Kaninchen-Anti-Calnexin (GeneTex, GTX 101676) verwendet , 1:1000), Maus-Anti-β-Actin (Sigma, 1:5000), Kaninchen-Anti-TSG101 (Abcam, 1:1000), Maus-Anti-Syntenin-1 (Origene, TA504796, 1:1000), Kaninchen-Anti -Annexin A1 (Abcam, ab214486, 1:1000), Ziegen-Anti-Nidogen-1 (R&D Systems, AF2570), Ziegen-Anti-PAPP-A (R&D Systems, AF2487), Maus-Anti-PAPP-A (Hytest, 4PD4) und Maus-Anti-CD81 (Klon B-11, Santa Cruz, 1:1000). Zu den Sekundärantikörpern gehörten Alexa680-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus (Thermo Fisher Scientific, 1:7500) und IRG800-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen (LI-COR Biosciences, 1:7500). Die Bildgebung wurde mit einem Odyssey-Infrarot-Imager (LI-COR Biosciences) bei 700 und 800 nm durchgeführt. CD63 wurde in nicht-reduzierten Proteinproben nachgewiesen.

140.000 HMEC-1 wurden einen Tag vor der Stimulation in eine Platte mit 48 Vertiefungen ausplattiert. 3 Stunden vor der Stimulation wurden HMEC-1 unter Verwendung von basalem MCDB131-Medium ausgehungert. 6 × 1010, 2 × 1010, 3 µg oder 1 µg EVs wurden 30 Minuten lang doppelt zugegeben, um HMEC-1 zu stimulieren. Als Negativkontrolle wurde PBS zugesetzt. Für Inhibitionsexperimente wurden 3 Stunden lang verschiedene Dosen (100–2000 nM) Picropodophyllin (PPP; Calbiochem) zugegeben, oder 1 Stunde vor der EV-Zugabe zum Basalmedium wurden 10 µg/ml Maus-Anti-IntegrinαVβ3-Antikörper (Novus Biologicals) zugesetzt. Als Positivkontrolle wurde eine Stimulation mit 200 ng/ml rekombinantem IGF-1 (PromoCell) oder 1 µg/ml Nidogen-1 (R&D Systems) einbezogen. Für die Phosphoproteomanalyse wurden 260.000 HMEC-1 einen Tag vor der Stimulation mit 10 × 1010 EVs oder PBS in einer Platte mit 24 Vertiefungen ausplattiert. Die Zellen wurden unter Verwendung von cOmplete Lysis-M EDTA-freiem Lysepuffer (Roche), ergänzt mit PhosSTOP-Phosphataseinhibitoren (Roche), lysiert und 10 Minuten lang bei 4 ° C und 14.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstände wurden für weitere Western-Blot-Experimente und (Phospho-)Proteomanalysen wie unten beschrieben verwendet.

Der Gesamtproteingehalt von HMEC-1-Lysaten wurde mit einem Pierce microBCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt und die Proteine ​​​​mit Western Blot analysiert. Die Proben wurden mit NuPAGE-Probenreduktionsmittel (Thermo Fisher Scientific) und NuPAGE-Probenpuffer (Thermo Fisher Scientific) gemischt, 10 Minuten lang auf 90 °C erhitzt und einer Elektrophorese über 4–12 % Bis-Tris-Polyacrylamidgelen (Thermo Fisher Scientific) unterzogen ). Proteine ​​wurden auf Invitrolon PVDF-Membranen (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung des iBlot 2 Dry-Blotting-Systems (Thermo Fisher Scientific) geblottet. Anschließend wurden die Membranen mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) oder mit 50 % v/v Intercept Blocking Buffer (LI-COR Biosciences) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) blockiert. Primäre und sekundäre Antikörperinkubationen wurden in 0,5 % BSA in TBS mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T) oder in 50 % v/v Intercept Blocking Buffer in TBS-T durchgeführt. Zu den Primärantikörpern gehörten Kaninchen-Anti-Phospho-ERK (Phospho-p44/p42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204, Cell Signaling Technology, 1:1000), Kaninchen-Anti-ERK (p44/p42 (Erk1/2), Cell Signaling Technology, 1:1000), Kaninchen-Anti-Phospho-AKT (Ser473, Klon D9E, Cell Signaling Technology, 1:1000), Kaninchen-Anti-AKT (Cell Signaling Technology, 1:1000) und Maus-Anti-β-Actin ( Sigma, 1:5000. Zu den Sekundärantikörpern gehörten HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (DAKO) oder Alexa680-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Thermo Fisher Scientific, 1:7500) und IRG800-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (LI-COR). Biowissenschaften, 1:7500). Proteine ​​wurden mit Chemilumineszenz-Peroxidase-Substrat (Sigma) unter Verwendung eines Chemi DocTM XRS+-Systems (Bio-Rad) und der Image LabTM-Software nachgewiesen, oder die Bildgebung wurde auf einem Odyssey-Infrarot-Imager (LI-COR Biosicences) bei 700 durchgeführt nm und 800 nm.

In einer Monoschicht von HMEC-1 in einer Platte mit 48 Vertiefungen wurde ein Kratzer gemacht und alle schwimmenden Zellen entfernt. Das Medium wurde durch Basis-MCDB131 mit oder ohne 2 × 1010 oder 1 µg EVs oder gleiche Volumina PBS ersetzt. Als Positivkontrolle wurde MCDB131-Medium, ergänzt mit 20 % FBS, einbezogen. Für Hemmungsexperimente wurden 10 µg/ml Maus-Anti-IntegrinαVβ3-Antikörper (Novus Biologicals) gleichzeitig mit der EV-Zugabe hinzugefügt. Als Positivkontrolle wurde eine Stimulation mit 1 µg/ml Nidogen-1 (R&D Systems) einbezogen. Bei 0 und 6 Stunden wurden Hellfeldbilder mit einem EVOS-Mikroskop (Life Technologies) aufgenommen. Der prozentuale Abschluss und die absolute Migrationsdistanz wurden nach 6 Stunden bestimmt. Der relative Wundverschluss wurde relativ zur PBS-Kontrolle berechnet.

Zwei Millionen HMEC-1 wurden in Suspension mit Cytodex 3-Mikroträgerkügelchen (Cytiva) 4 Stunden lang bei 37 °C unter regelmäßiger Bewegung inkubiert, um die Zellanlagerung an die Kügelchen zu ermöglichen. Anschließend wurden die Kügelchen mit Zellen über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am folgenden Tag wurde eine Mischung aus basalem MCDB131-Medium mit 4 µg EV-Behandlungen oder gleichen Volumina PBS und wachstumsfaktorreduziertem Matrigel (Corning, Verhältnis 4:1:1) hergestellt und etwa 50 Perlen zwischen zwei Schichten der Mischung eingebettet in jedem Well einer 96-Well-Platte. Nach der Verfestigung der Matrigel-Mischung wurden 200 μl basales MCDB131-Medium darüber gegeben und die Platten wurden bei 37 °C inkubiert. Nach 72 Stunden wurden Hellfeldbilder von 6 Perlen pro Vertiefung mit einem EVOS-Mikroskop (Life Technologies) aufgenommen. Die Bilder wurden mithilfe von ImageJ mit dem NeuronJ-Plugin auf Anzahl der Sprossen, mittlere Länge pro Spross und Gesamtlänge pro Perle analysiert.

Für menschliches PAPP-A und NID1 spezifische Single Guide RNAs (sgRNAs) wurden mit dem CRISPOR-Designtool (http://crispor.tefor.net/) entworfen und auf das Homo-Sapiens-Genom untersucht, um mögliche Off-Target-Effekte zu minimieren. Alle sgRNA-Sequenzen und PCR-Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. sgRNA-exprimierende Plasmide wurden durch Klonierung der sgRNA im LentiCRISPv2-Vektor (Addgen-Plasmid-Nummer 52961) durch Oligo-Annealing von phosphorylierten sgRNA-Oligo-Duplexen in Esp3I-Stellen erreicht. Phosphorylierte sgRNA-Oligo-Duplexe wurden durch Ligieren von Ober- und Unterstrang-Oligos (HPLC-gereinigt, IDT) mit T4-PNK-Ligase bei 37 °C für 30 Minuten, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation bei 95 °C und einem Temperaturabfall von 5 °C gebildet pro Minute auf 25 °C. Um polyklonale stabile CPC-Linien zu erzeugen, wurden CPCs mit CRISPv2-exprimierenden Lentiviren infiziert. HEK293fT-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert und Transfektionen von Plasmid-DNA wurden unter Verwendung von Lipofectamine 3000-Reagenz (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, als die Zellen eine Konfluenz von 50–60 % aufwiesen. 1 µg LentiCRISPv2-Plasmid (Addgene #52961) wurde mit 1 µg pCMV delta R8.2 (Addgene #12263) und 0,5 µg pCMV-VSV-G (Addgene #8454) Helferplasmiden gemischt und in einem Verhältnis von 1 µg zu 1 µl mit komplexiert Lipofectamine 3000-Reagenz und im Verhältnis 1 µg zu 2 µl mit P3000-Reagenz. Die Komplexe wurden zu den Zellen gegeben und 48 Stunden lang inkubiert, bevor das virushaltige Medium geerntet wurde. Zelltrümmer wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 350 × g und Filtration unter Verwendung eines 0,45 µm SCFA-Spritzenfilters (Corning) entfernt. CPCs wurden in einer Platte mit 24 Vertiefungen bis zu einer Konfluenz von 50 % kultiviert, bevor sie mit 1 ml virushaltigem Medium mit 8 ng/ml Polybren ergänzt wurden. Nach 24 Stunden wurde das Medium auf SP++-Medium umgestellt und stabile polyklonale Zelllinien wurden durch Puromycin-Selektion erzeugt, beginnend 48 Stunden nach der Transduktion. Einzelne Knock-out (KO)-Klone wurden durch serielles Verdünnen polyklonaler KO-Linien zu Einzelzellsuspensionen und Expandieren einzelner Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen erhalten. Nach der Konfluenz wurde die genomische DNA mit dem GeneJet Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) gemäß dem empfohlenen Protokoll extrahiert und mithilfe der Sanger-Sequenzierung auf eine homozygote biallelische Mutation untersucht.

Genomische DNA wurde aus stabilen polyklonalen CPCs mit dem GeneJet Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) gemäß dem empfohlenen Protokoll extrahiert. Die genomische Region, die die CRISPR/Cas9-Zielstelle flankiert, wurde zunächst durch PCR unter Verwendung von Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (NEB) auf einer 100-ng-DNA-Vorlage amplifiziert. Nach einer anfänglichen Inkubation bei 98 °C für 30 Sekunden wurden 35 Zyklen mit 98 °C für 10 Sekunden, 65 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden verwendet, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten . Anschließend wurden die Amplikons einem Schmelz- und erneuten Annealing-Prozess in NEBuffer 2 (New England Biolabs) unterzogen, um die Bildung von Heteroduplexen zu ermöglichen: 95 °C für 5 Minuten, 95 °C bis 85 °C, ansteigend mit 2 °C/s, 85 ° C bis 25 °C bei 0,1 °C/s. Nach dem erneuten Annealing wurden die Produkte gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll 30 Minuten lang bei 37 °C mit T7-Endonuklease I (New England Biolabs) behandelt und die Verdauungsprodukte auf 1 % Agarosegel mit Ethidiumbromid aufgetrennt. Die Gele wurden mit einem Gel Doc XR+ Bildgebungssystem (Bio-Rad) abgebildet. Um den Frameshift auf genomischer DNA-Ebene an der CRISPR/Cas9-Zielstelle zu bestätigen, wurden amplifizierte PCR-Produkte durch Sanger-Sequenzierung analysiert.

Biologische Dreifachkopien isolierter Elektrofahrzeuge wurden bei –80 °C gelagert und die Proteinzusammensetzung wurde mittels Massenspektrometrie (MS) analysiert. Zu diesem Zweck wurden EVs mit 2 % SDS-Lysepuffer (2 % SDS, 50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM DTT) lysiert und für die MS-Analyse unter Verwendung einer modifizierten Version des SP3-Proteinreinigungs- und Verdauungsprotokolls vorbereitet53. Das gesamte extrahierte Protein aus jeder Probe wurde mit 4 mM Chloracetamid alkyliert. Sera-Mag SP3-Bead-Mix (20 µl, Cytiva) wurde zusammen mit 100 % Acetonitril bis zu einer Endkonzentration von 70 % in die Proteinprobe überführt. Die Mischung wurde unter Rotation 18 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Mischung wurde auf das Magnetgestell gegeben und der Überstand verworfen, gefolgt von zwei Wäschen mit 70 % Ethanol und einer mit 100 % Acetonitril. Die Perlen-Protein-Mischung wurde in 100 µl LysC-Puffer (0,5 M Harnstoff, 50 mM HEPES pH: 7,6 und Enzym (LysC) zu Protein-Verhältnis von 1:50) rekonstituiert und über Nacht inkubiert. Schließlich wurde Trypsin in einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 in 100 µl 50 mM HEPES, pH 7,6, zugegeben und über Nacht inkubiert, gefolgt von der Reinigung des SP3-Peptids. Kurz gesagt, der Probe wurden 20 µl Sera-Mag SP3-Perlenmischung (10 µg/µl) zugesetzt. Als nächstes wurde 100 % Acetonitril zugegeben, um eine Endkonzentration von 95 % zu erreichen. Die Proben wurden mit einer Pipette gemischt und 20 Minuten lang bei RT inkubiert und dann auf ein Magnetgestell gelegt. Der Überstand wurde abgesaugt, verworfen und die Perlen wurden in 180 µl Acetonitril gewaschen. Die Proben wurden aus dem Magnetgestell entnommen und die Perlen in 20 µl einer Lösung (3 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) rekonstituiert, gefolgt von einer 1-minütigen Ultraschallbehandlung. Anschließend wurden die Perlen erneut auf ein Magnetgestell gelegt und der Überstand gewonnen und in ein MS-Fläschchen überführt. Die Peptide wurden in der mobilen LC-Phase A (3 % Acetonitril (ACN), 0,01 % FA) gelöst und in das Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-System injiziert.

Die Daten wurden mit einem Dionex UltiMate™ 3000 RSLCnano-System erfasst, das an ein Q-Exactive-Massenspektrometer (Thermo Scientific) gekoppelt war. Die Proben wurden auf einer C18-Schutz-Entsalzungssäule (Acclaim PepMap 100, 75 µm × 2 cm, nanoViper, C18, 5 µm, 100 Å) aufgefangen und auf einer 50 cm langen C18-Säule (Easy Spray PepMap RSLC, C18, 2 µm) getrennt , 100 Å, 75 µm × 50 cm). Das Nanokapillarlösungsmittel A bestand aus 95 % Wasser, 5 % DMSO, 0,1 % Ameisensäure; und Lösungsmittel B war 5 % Wasser, 5 % DMSO, 95 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure. Bei einem konstanten Fluss von 0,25 μl/min stieg der gekrümmte Gradient in 180 Minuten von 6 % B auf 43 % B, gefolgt von einem steilen Anstieg auf 100 % B in 5 Minuten.

Das Massenspektrometer wurde im datenabhängigen Modus betrieben. Peptide wurden in einer nESI-Quelle bei 1,9 kV ionisiert und bei 60 % der Amplitude der HF-Linse fokussiert. Vollständige MS1-Scan-Spektren von 400 bis 1200 m/z wurden im Orbitrap mit einer Auflösung von 60.000 aufgenommen, wobei das AGC-Ziel auf 1 × 106 oder für eine maximale Injektionszeit von 250 ms eingestellt war. Für jeden Zyklus wurden die 10 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen zur Fragmentierung isoliert (mit einem Isolationsfenster von 2 m/z), während Vorläuferionen mit dem Ladungszustand 1 oder nicht zugeordnet von der Fragmentierung ausgeschlossen wurden. Der dynamische Ausschluss wurde auf eine Dauer von 20 s festgelegt. Die Fragmentierung erfolgte unter Verwendung einer festen HCD-normalisierten Kollisionsenergie von 30 %. Fragmentionen wurden akkumuliert, bis ein Zielwert von 2 × 105 Ionen erreicht wurde, oder für eine maximale Injektionszeit von 140 ms vor der Injektion in den Orbitrap für die MS2-Analyse mit einer Auflösung von 30.000.

Der Gesamtproteingehalt stimulierter HMEC-1-Lysate wurde unter Verwendung eines microBCA-Protein-Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Zwei biologische Replikate wurden gepoolt, um 50 µg Protein für die anschließende Phosphoanreicherungsanalyse zu erhalten. Die Proteine ​​wurden mit der Methanol/Chloroform-Methode ausgefällt: 1 Volumenteil der Probe wurde nacheinander mit 4 Volumenteilen Methanol (Sigma-Aldrich), 1 Volumenteil Chloroform (Sigma-Aldrich) und 3 Volumenteilen Wasser gemischt. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei RT mit 5000 U/min zentrifugiert und die obere Schicht entfernt. Dann wurden 3 Volumina Methanol eingearbeitet und 10 Minuten lang bei RT mit 5000 U/min zentrifugiert, und die flüssige Phase wurde verworfen, während das Pellet (Proteine) an der Luft trocknen konnte. Die Proteinpellets wurden in 50 μl Verdauungspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,5, 1 % SDC (Sigma-Aldrich), 5 mM TCEP und 30 mM CAA) rekonstituiert, um die Proteine ​​zu reduzieren und zu alkylieren. Anschließend wurde der Proteinverdau durch Zugabe von LysC im Verhältnis 1:100 (Gew./Gew.) für 1 Stunde bei 37 °C und anschließende Inkubation über Nacht bei 37 °C mit Trypsin im Verhältnis 1:25 (Gew./Gew.) durchgeführt. Die Verdauungen wurden mit 0,5 % FA abgeschreckt und der SDC-Niederschlag durch 5-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g und 4 °C pelletiert. Die Überstände wurden zum Entsalzen zweimal in Pierce C18 10 µL Bed Stage Tips (Thermo Fisher) geladen, mit 100 µL 0,1 % FA gewaschen, und die Peptide wurden zweimal auf 80 % ACN, 0,1 % FA eluiert, vakuumgetrocknet und bei –80 °C gelagert C vor der Phosphopeptidanreicherung.

Phosphorylierte Peptide wurden auf Fe(III)-NTA 5 μL (Agilent Technologies)-Kartuschen unter Verwendung der AssayMAP Bravo-Plattform (Agilent Technologies) angereichert. Fe(III)-NTA-Kartuschen wurden mit 250 μl 0,1 % TFA in ACN bei einer Flussrate von 100 μl/min vorbereitet und mit 250 μl Ladepuffer (80 % ACN/0,1 % TFA) bei einem Fluss von 50 μl/min äquilibriert Rate. Die Proben wurden in 200 μl Ladepuffer gelöst und mit einer Flussrate von 3 μl/min auf die Kartusche geladen, gefolgt von einem 250 μl-Waschvorgang in Ladepuffer mit 20 μl/min. Der Ladungsdurchfluss, der die nicht phosphorylierte Teilmenge des Proteoms enthielt, wurde für die weitere proteomische Charakterisierung aufbewahrt. Die Phosphopeptide wurden dann mit 35 μl 1 %igem Ammoniak bei 5 μl/min direkt in 35 μl 10 %ige Ameisensäure eluiert. Die Proben wurden vakuumgetrocknet und bis zur LC-MS/MS-Analyse bei –80 °C gelagert.

Die Daten wurden mit einem Ultimate 3000-System (Thermo Fischer Scientific) erfasst, das an ein Orbitrap Exploris 480-Massenspektrometer (Thermo Fischer Scientific) gekoppelt war. Die Peptide wurden 5 Minuten lang in Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) eingefangen (Dr. Maisch Reprosil C18, 3 µM, 2 cm × 100 µM), bevor sie auf einer analytischen Säule (Agilent Poroshell, EC-C18, 2,7 µM) getrennt wurden. 50 cm × 75 µM). Lösungsmittel B bestand aus 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril. Das Einfangen von Peptiden wurde 2 Minuten lang in 9 % B bei einer Flussrate von 300 nL/min durchgeführt. Für die vollständige Proteomanalyse wurden die Peptide in einem Gradienten von 13–44 % B in 95 Minuten aufgetrennt, während für die Phosphoproteomanalyse die Peptide in einem Gradienten von 9–36 % B in 36 Minuten aufgetrennt wurden gefolgt von einem steilen Anstieg auf 99 % B in 3 Minuten, einem 5-minütigen Waschen in 99 % B und einer 10-minütigen Neuäquilibrierung bei 9 % B. Die Flussrate wurde bei 300 nL/min gehalten. Das Massenspektrometer wurde im datenabhängigen Modus betrieben. Peptide wurden in einer nESI-Quelle bei 1,9 kV ionisiert und bei 40 % der Amplitude der HF-Linse fokussiert. Vollständige MS1-Scan-Spektren von 375–1600 m/z wurden im Orbitrap mit einer Auflösung von 60.000 aufgenommen, wobei das AGC-Ziel auf 1 × 106 eingestellt war und die maximale Injektionszeit automatisch berechnet wurde. Die Zykluszeit für MS2-Fragmentierungsscans wurde auf 1 s eingestellt. Nur Peptide mit den Ladungszuständen 2–6 wurden fragmentiert, und der dynamische Ausschluss wurde auf eine Dauer von 10 ms für 36-minütige Gradienten und auf 16 ms für 95-minütige Gradienten eingestellt. Die Fragmentierung erfolgte unter Verwendung einer festen HCD-normalisierten Kollisionsenergie von 28 %. Fragmentionen wurden akkumuliert, bis ein Zielwert von 1 × 105 Ionen unter einer automatisierten Berechnung der maximalen Injektionszeit erreicht wurde, mit einem Isolationsfenster von 1,4 m/z vor der Injektion in den Orbitrap für die MS2-Analyse mit einer Auflösung von 30.000. Proteomics-Rohdaten wurden über das PRIDE-Repository54 beim ProteomeXchange Consortium hinterlegt und können über die Kennung PXD030779 abgerufen werden.

Alle (Phospho)Proteomics-Rohdaten wurden in MaxQuant (v_1.6.10.43)55 mit der SwissProt-Referenzproteomdatenbank für Menschen abgeglichen (enthält 20.381 Proteine ​​und wurde im März 2021 von Uniprot heruntergeladen). Die Spektren wurden mit der integrierten Andromeda-Suchmaschine von MaxQuant durchsucht. Als Verdauungsenzym wurde Trypsin eingestellt und es waren bis zu zwei fehlende Spaltungen zulässig. Die Carbamidomethylierung von Cysteinen wurde als feste Modifikation festgelegt, während die N-terminale Acetylierung von Proteinen und die Methioninoxidation als variable Modifikationen festgelegt wurden. Für die phosphoproteomische Datenanalyse wurden auch die Phosphorylierung von Serin, Tyrosin und Threonin als variable Modifikationen einbezogen. Die markierungsfreie Quantifizierung (LFQ) wurde mit einem Mindestverhältnis von zwei und sowohl Razor- als auch Unique-Peptiden zur Quantifizierung ermöglicht. Der Abgleich zwischen Läufen war aktiviert, das Abgleichszeitfenster war immer auf 0,7 Minuten eingestellt, während das Ausrichtungszeitfenster für die Proteomanalyse auf 20 Minuten und für die Phosphoproteomanalyse auf 10 Minuten eingestellt war. Die Vorläuferionentoleranz wurde für die erste Suche auf 20 ppm und nach der Neukalibrierung auf 4,5 ppm eingestellt, und die Fragmentionentoleranz wurde auf 20 ppm eingestellt. Mithilfe einer Reverse-Decoy-Datenbankstrategie wurde eine Falscherkennungsrate (FDR) von 1 % auf PSM-, Standort- und Proteinebene festgelegt. Die Daten wurden mit der Perseus-Software (v_1.6.14)56 analysiert. In jeder Analyse wurden die in zwei von drei Replikaten quantifizierten Proteine ​​(LFQ) log2-transformiert und fehlende Werte wurden für jede Probe einzeln aus der Normalverteilung ersetzt. Für die phosphoproteomische Analyse, bei der ein intensitätsbasierter MS-Injektionsausgleich nicht möglich war, wurden die Phosphosit-Intensitäten auf die maximale kumulative Intensität normalisiert (gefunden in Probe veh-EV, Replikat 2). Statistische Unterschiede wurden immer durch einen zweiseitigen Student-T-Test oder eine einfaktorielle ANOVA bewertet und korrigierte p-Werte (q-Wert) wurden mithilfe der Permutationsmethode mit bis zu 250 Iterationen berechnet. Proteine ​​wurden als signifikant angesehen, wenn der q-Wert ≤ 0,05 war. Die Genontologieanalyse wurde unter Verwendung von PANTHER57 mit dem menschlichen Proteom als Hintergrundgensatz durchgeführt. Alle Diagramme wurden mit R-Paketen58 erstellt.

Konzentrierte EVs wurden 15 Minuten lang bei RT an kohlenstoffbeschichteten Formvar-Gittern adsorbiert. Nach einem PBS-Waschvorgang wurden die Gitter 30 Minuten lang bei RT in 1 % Glutaraldehyd in PBS-Fixierungspuffer fixiert, gefolgt von einer Gegenfärbung mit Uranyloxalat. Gitter wurden in eine Mischung aus 1,8 % Methylcellulose und 0,4 % Uranylacetat bei 4 °C eingebettet und auf einem Jeol JEM-1011 TEM-Mikroskop (Jeol) abgebildet.

Statistische Analysen der Ergebnisse des Scratch-Assays, des Sprouting-Assays und der Western-Blot-Densitometrie wurden mit Prism 5.0 (GraphPad Software Inc.) durchgeführt. Für die meisten Experimente wurden drei biologisch unabhängige Wiederholungen durchgeführt und ansonsten in der entsprechenden Abbildungslegende anders angegeben. Der statistische Unterschied zwischen zwei Gruppen wurde mithilfe eines ungepaarten Student-T-Tests und zur densitometrischen Analyse der WB-Ergebnisse mit zusätzlicher Welch-Korrektur analysiert. Unterschiede zwischen mehr als zwei Gruppen wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA getestet, gefolgt von Tukeys HSD-Mehrfachvergleichstest als Nachtest. Unterschiede mit zweiseitigen p-Werten < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten (phospho)proteomischen Datensätze sind im ProteomeXchange-Konsortium über das PRIDE-Repository54 verfügbar und können über die Kennung PXD030779 abgerufen werden. Numerische Quelldaten, die allen Grafiken und Diagrammen zugrunde liegen, finden Sie in den Zusatzdaten 1.

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Die Autoren danken der Proteomics Core Facility des Science for Life Laboratory, dem Karolinska Institutet für die Durchführung der LC-MS/MS-Analyse des EV-Proteoms und Cor Seinen für die hervorragende technische Unterstützung bei TEM. Abbildung 6a wurde mit BioRender (BioRender.com) entworfen. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des EVICARE-Stipendiums (Nummer 725229) an JS unterstützt

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Julia Bauzá-Martinez, Simonides Immanuel van de Wakker.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Wei Wu, Pieter Vader, Joost Petrus Gerardus Sluijter.

Abteilung für experimentelle Kardiologie, Universitätsklinikum Utrecht, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande

Marieke Theodora Roefs, Simonides Immanuel van de Wakker, Jiabin Qin, Willem Theodoor Olijve, Robin Tuinte, Marjolein Rozeboom, Christian Snijders Blok, Emma Alise Mol, Pieter Vader und Joost Petrus Gerardus Sluijter

Biomolekulare Massenspektrometrie und Proteomik, Bijvoet Center for Biomolecular Research und Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande

Julia Bauzá-Martinez & Wei Wu

Singapore Immunology Network (SIgN), ASTAR (Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung), Singapur, Singapur

Wei Wu

CDL Research, Universitätsklinikum Utrecht, Utrecht, Niederlande

Peter Vader

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PV, JS, WW, MTR und JB konzipierten und planten die Experimente. MTR, JB, SW, JQ, WO, RT, MR, CSB und EM führten die Experimente durch. MTR verfasste das Manuskript mit Unterstützung von JB, WW, PV und JS. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zum endgültigen Manuskript bei.

Korrespondenz mit Wei Wu, Pieter Vader oder Joost Petrus Gerardus Sluijter.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Milica Radisic und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Roefs, MT, Bauzá-Martinez, J., van de Wakker, SI et al. Von kardialen Vorläuferzellen abgeleitete extrazelluläre Vesikel fördern die Angiogenese sowohl durch assoziierte als auch co-isolierte Proteine. Commun Biol 6, 800 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05165-7

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Eingegangen: 16. September 2022

Angenommen: 24. Juli 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05165-7

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