Die DNA spüren - Hengyang Laser Welder Group Co., Ltd

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Einzelmolekülquantifizierung der Stärke und Sequenzspezifität von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren würde die Untersuchung der Protein-DNA-Bindung erleichtern. Hier zeigen wir, dass Bindungsereignisse zwischen dem katalytisch inaktiven Cas9-Ribonukleoprotein und jeder vordefinierten kurzen Sequenz doppelsträngiger DNA identifiziert werden können, indem Änderungen im Ionenstrom erfasst werden, wenn entsprechend gestaltete lineare DNA-Nanostrukturen mit Barcode und Cas9-bindenden doppelsträngigen DNA-Überhängen transloziert werden durch Festkörper-Nanoporen. Wir haben mit Barcodes versehene DNA-Nanostrukturen entworfen, um die Beziehungen zwischen der DNA-Sequenz und der DNA-Bindungsspezifität, der DNA-Bindungseffizienz und der DNA-Fehlpaarungstoleranz von Cas9 auf Einzelnukleotidebene zu untersuchen. Die auf Nanoporen basierende Erkennung von DNA-Barcode-Nanostrukturen kann dazu beitragen, das Design effizienter und spezifischer Ribonukleoproteine für biomedizinische Anwendungen zu verbessern, und könnte zu empfindlichen Proteinerkennungstests weiterentwickelt werden.

Die Erkennung von Nukleinsäuresequenzen durch Proteine ist für die Biologie von grundlegender Bedeutung. Aufgrund der Spezifität der Protein-DNA-Bindung bilden Wechselwirkungen zwischen diesen Biomolekülen die Grundlage vieler Biosensor-Tools, biomolekularer Engineering-Techniken und neuer Therapien1,2. Insbesondere Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/dCas9-Systeme haben sich als leistungsstarke Werkzeuge für die gezielte Genexpression sowie für die Diagnostik herausgestellt, und derzeit werden umfangreiche Arbeiten durchgeführt, um die Effizienz und Spezifität von CRISPR/Cas3,4 zu verbessern. Daher ist es wichtig, einfache und empfindliche Assays zu entwickeln, die die Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen in ihren gefalteten und funktionellen Zuständen analysieren, um ihr natives Verhalten zu erfassen. Darüber hinaus ist es unbedingt erforderlich, dass diese Methoden auf Unterschiede in der Sequenz einzelner Nukleotide reagieren, die sich erheblich auf die Bindung auswirken können.

Die Widerstandsimpulsmessung mit Festkörpernanoporen ist eine attraktive Methode zur Beurteilung von Bindungsereignissen. Die Technik bietet die Flexibilität, DNA, RNA und Proteine in ihrem ursprünglichen Zustand mit einem einzigen Sensorsystem zu untersuchen. Die Nanoporenerkennung basiert auf der Messung von Änderungen im Ionenstrom, wenn Moleküle mithilfe eines angelegten elektrischen Feldes durch eine nanometrische Pore getrieben werden. Die Änderung des Ionenstroms aufgrund eines Translokationsereignisses spiegelt die Größe, Form und Ladung des Moleküls wider5. Es gibt zwei Arten von Nanoporen: biologische und Festkörper-Nanoporen. Obwohl biologisch gewonnene Protein-Nanoporen ideal für die DNA-Sequenzierung geeignet sind6, ermöglichen Festkörper-Nanoporen die Kontrolle über die Porengröße während des Herstellungsprozesses und ermöglichen so den Nachweis einer breiten Palette von Analyten.

Obwohl diese Vielseitigkeit die Analyse einer Vielzahl von Biomolekülen ermöglicht, stellt die mangelnde Spezifität der Erkennung auch eine Herausforderung für den Multiplex-Nachweis dar, bei dem die interessierenden Ziele leicht zu unterscheiden sein sollten. Um diese Hürde zu überwinden, nutzen wir die DNA-Nanotechnologie, die den Entwurf und Zusammenbau maßgeschneiderter Nanostrukturen ermöglicht, die spezifische Bindungsstellen für Proteine von Interesse enthalten7.

In diesem Artikel stellen wir Festkörper-Nanoporen her, indem wir Quarzkapillaren, auch Nanopipetten genannt, ziehen, die als allgemeines Nachweiswerkzeug verwendet werden. Doppelsträngige DNA (dsDNA) erzeugt einen Ionenstromabfall im Nanoporensignal. Bei der Bindung eines Analyten, beispielsweise eines Proteins, an die dsDNA entstehen sekundäre Stromspitzen. Durch die Gestaltung spezifischer Bindungsstellen oder -sequenzen entlang eines DNA-Strangs wird ein identifizierbares Muster erzeugt. Dieser Fingerabdruck ist als eindeutige Signatur von Spitzen im Ionenstrom erkennbar. Die Markierung und Kartierung gezielter nativer DNA-Sequenzen in Nanoporen wurde bisher mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt, darunter Peptid-Nukleinsäuresonden8,9, biochemische Ligation10, Transkriptionsfaktoren11 und chemische Modifikation mit Methyltransferase und Biotinylierung12. Kürzlich wurde die Verwendung der Nanoporenanalyse zur Messung der Bindung einer Variante von katalytisch inaktivem oder totem Cas9 (dCas9) an dsDNA demonstriert2,13 Unser System baut auf diesen ersten Proof-of-Concept-Arbeiten auf, indem es entworfene DNA-Nanostrukturen für Benutzer einführt. definierte DNA-Zieltests und erweiterte so den Anwendungsbereich der Nanoporenerkennung, der DNA-Nanotechnologie und des Screenings von Protein-DNA-Wechselwirkungen. Hier zeigen wir, dass dCas9-Komplexe, wenn sie sorgfältig entworfen und getestet werden, als Markierung fungieren können, die eine hochspezifische Kartierung der DNA ermöglichen, um einzelne Basenpaaränderungen zu bestimmen, was für die Diagnostik besonders wichtig ist4,14.

Das dCas9-Protein ist eine katalytisch inaktivierte Form des CRISPR-assoziierten Proteins Cas9, das eine 20 Basenpaare (bp) lange Ziel-dsDNA-Sequenz bindet, aber nicht schneidet. Das dCas9-Ribonukleoprotein (RNP) ist ein Komplex, der aus einem dCas9-Protein und Guide-RNA (gRNA) besteht. Die gRNA besteht aus zwei RNA-Strängen, einschließlich der CRISPR-RNA (crRNA), die zur Ziel-dsDNA-Sequenz komplementär ist, sowie einer transaktivierenden crRNA (tracrRNA). Die Bindungsstelle des dCas9 an die dsDNA wird durch Änderung der Sequenz der crRNA programmiert. Das RNP bindet in Gegenwart eines NGG-Protospacer-Nachbarmotivs (PAM) und hybridisiert dann mit 8–12 Zielnukleotiden stromaufwärts des PAM, auch bekannt als „Seed“-Region. Fehlpaarungen in der Saatregion verhindern, dass das RNP einen Komplex mit dem Ziel bildet, wohingegen Fehlpaarungen stromabwärts in der „distalen“ Region hauptsächlich dazu dienen, die Lebensdauer der Komplexe zu verkürzen15.

Indem das dCas9 auf verschiedene dsDNA-Sequenzen ausgerichtet wird, können einzigartige und sequenzspezifische Muster oder „Barcodes“ des gebundenen dCas9 erstellt und für die Multiplex-Identifizierung von DNA mithilfe einer Nanopore2 verwendet werden. Um das volle Potenzial dieser dCas9-basierten Systeme auszuschöpfen, müssen sie jedoch quantitativ, skalierbar und spezifisch sein, was ein Screening von dCas9 erfordert, um eine hohe Bindungseffizienz und Spezifität zu selektieren. Die Bindung hängt stark von der gRNA-Sequenz ab; Während diese Interaktion in einigen Fällen unglaublich spezifisch ist, können andere Sequenzen Hunderte von Off-Target-Sites aufweisen, was den Nutzen dieser Systeme einschränkt16. Aktuelle Methoden zur Beurteilung der Bindung von dCas9 an DNA basieren hauptsächlich auf Sequenzierung und Computermodellierung17,18,19,20.

Berechnungsmethoden sind sehr nützlich, um die Versuchsplanung zu steuern, sind jedoch aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber Datenschwankungen und unzureichenden Trainingsdaten begrenzt21. Obwohl darüber hinaus bekannt ist, dass Fehlpaarungen die Wahrscheinlichkeit und Stabilität von Bindungsereignissen für dCas9 beeinflussen, ist es aus mehreren Gründen schwierig, einen einzigen Satz allgemeiner Regeln für die Bewertung der Fehlpaarungstoleranz zu erstellen21. Erstens basieren fast alle verfügbaren Rechenwerkzeuge auf umfangreichen experimentellen Datensätzen, die auf die Vorhersage der Spaltung und nicht der Bindung ausgerichtet sind, und für Cas9 wurde gezeigt, dass die Beziehung zwischen Bindung und Spaltung komplex ist18,22. Eine zusätzliche Ebene der Komplexität ergibt sich aus dem Beweis, dass die Spaltungseffizienz weitgehend von der gRNA-Sequenz abhängt, wobei jede Sonde über eine einzigartige Guide-intrinsische Mismatch-Toleranz (GMT) verfügt23,24. GMT macht es schwierig, die Spezifität einer Sonde vorherzusagen, ohne sie zu testen, was die Notwendigkeit eines Tools zum schnellen Screening von Testsonden unterstreicht.

Durch die Kombination von Einzelmolekül-Nanoporenmessungen mit DNA-Nanotechnologie haben wir ein System geschaffen, das die spezifischen Bindungswechselwirkungen von dCas9-Sonden und Ziel-dsDNA auf einzigartige und genaue Weise beurteilen kann. Durch den Entwurf von DNA-Nanostrukturen, die an einem Ende der Nanostruktur mit manipulierten Hantel-Barcodes versehen sind, haben wir ein einzigartiges Spitzenmuster erstellt, das einer spezifischen Zielsequenz für dCas9 entspricht (Lit. 7). Wir haben den Nutzen erweitert, indem wir entworfene dsDNA-Überhänge hinzugefügt haben, die es uns ermöglichten, die sequenzspezifische gRNA-Bindungsspezifität von dCas9-Sonden an jede kurze DNA-Sequenz von Interesse schnell zu beurteilen. Zusätzlich zur Messung der dCas9-Bindung an die passende Zielsequenz kann der dsDNA-Überhang mit Mutationen gestaltet werden, um die Empfindlichkeit der crRNA gegenüber diesen Modifikationen zu testen. Wir zeigen, dass diese Methoden quantitativ sind und dass sie unterschiedliche DNA-Konzentrationen mit und ohne eingeführte Mutationen in derselben Probe unterscheiden können. Dieser Ansatz zum Testen von gRNAs kann das Design von dCas9-RNPs, die für Genexpressions- und Diagnoseanwendungen verwendet werden, effizienter und spezifischer machen.

DNA-Nanostrukturen haben sich bereits als nützliche Werkzeuge für die Multiplex-Messung der Bindung von Biomolekülen mithilfe des Nanoporen-Sensorsystems erwiesen7. Abbildung 1 stellt das Design der DNA-Nanostruktur und des Nanoporen-Sensorsystems vor und demonstriert seine Verwendung zum Nachweis der Bindung eines dCas9-RNP an eine bestimmte Ziel-dsDNA-Überhangsequenz.

a, Schematische Darstellung der DNA-Struktur mit DNA-Barcode-Region und dCas9-Überhang. Sowohl die Sequenzen, die für die Hantelregion verwendet werden, die den Barcode erstellt (blau), als auch das Schema der Ziel-DNA-Region, die als Überhang fungiert (grün), sind hervorgehoben. Zusätzlich werden die am dCas9 RNP beteiligten Komponenten gezeigt. b: Festkörper-Nanopore mit zwei verschiedenen DNA-Nanostrukturen (11111 und 11001), gemischt in Lösung. Beide Strukturen werden mit und ohne dCas9-Bindung gezeigt, was die Fähigkeit zur Bestimmung der Spezifität und Bindungseffizienz unterstreicht. c, Stromspuren aus der Nanopore der verschiedenen DNA-Nanostrukturen, wenn zwei Sonden hinzugefügt werden. Der 50-bp-Überhang kann nicht aufgelöst werden, es sei denn, dCas9 ist gebunden.

In Abb. 1a zeigen wir ein Schema der DNA-Nanostruktur. Wie im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben, werden die DNA-Nanostrukturen aus einem einzelsträngigen DNA-Rückgrat (ssDNA) mit zum Rückgrat komplementären Stapeloligos erstellt, die über dessen Länge binden. Die Abschnitte der Nanostruktur, die vollständig zum ssDNA-Rückgratstrang komplementär sind, erscheinen bei einem Translokationsereignis als Stromabfall, der der dsDNA entspricht. Ein Abschnitt der Klammeroligos wird ersetzt und ein Teil der DNA-Nanostruktur wird in einen DNA-Barcode umgewandelt, der aus fünf Spitzen besteht, die entweder auf „0“ oder „1“ gesetzt werden können. Das Barcode-Design basiert auf früheren Arbeiten, die optimiert wurden, um klar unterscheidbare Spitzen in Nanoporen mit Durchmessern um 15 nm zu erzeugen (Lit. 7). Während dieses Barcode-Design uns nur 25 (32) Sequenzen zur Verfügung stellt, die getestet werden können, haben wir bereits die maximalen Grenzen von Barcodes erkundet. Wir können die Dichte der Nanostrukturen und das Signal-Rausch-Verhältnis erhöhen, indem wir kleinere Nanoporen mit 56 Bits auf einem einzigen DNA-Träger verwenden, was eine Bibliothek von 256 (>1016) Molekülen ermöglicht25. Die Anzahl der gemultiplexten Protein-DNA-Wechselwirkungen wird nur durch die Anzahl der Nanoporen und unsere Fähigkeit, diese DNA-Nanostrukturen zusammenzubauen, begrenzt. Im Sensorbereich der Nanostruktur wurden zwei Oligos entwickelt, um einen dsDNA-Überhang mit einer Länge von 50 bp zu erzeugen. Dieser dsDNA-Überhang kann jede beliebige DNA-Sequenz von Interesse darstellen, einschließlich Zielsequenzen für die dCas9-Bindung.

Die verschiedenen in Abb. 1b dargestellten Nanostrukturen können in Lösung kombiniert werden und einzeln durch die Nanopore wandern. In diesem Schema sind zwei verschiedene Barcode-Nanostrukturen 11111 und 11001 mit gebundenem dCas9 und ungebundenem dCas9 zusammen mit den von den Strukturen während der Nanoporentranslokation erzeugten Signalen dargestellt (Abb. 1c). Eine Rohstromspur sowohl mit als auch ohne DNA/Protein ist in der ergänzenden Abbildung 1 zu sehen. Die Translokation kann in beide Richtungen erfolgen, wie in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Wenn dCas9 nicht an die Ziel-dsDNA in der Überhangregion bindet, ist dies der Fall das Fehlen der zusätzlichen Spitze. Die Überhangregion enthält nur 50 bp dsDNA unterhalb der Nachweisgrenze unserer Nanoporen und erzeugt daher keine deutliche Signalspitze. Somit kann das Vorhandensein oder Fehlen einer dCas9-Bindung an die Nanostruktur durch einen einfachen Schwellenwertalgorithmus um die erwartete Spitzenposition herum klar unterschieden werden.

Die Einzelbasenspezifität von dCas9 verleiht ihm einen Vorteil als diagnostisches Werkzeug zur Untersuchung von Punktmutationen in klinisch relevanten Sequenzen. Die einzelne Punktmutation im katG315-Gen bei Mycobacterium tuberculosis ist bei 64,2 % der Resistenzfälle für die Antibiotikaresistenz gegen Isoniazid verantwortlich26. Die Ziel-DNA-Region, die diese Mutation enthält, wurde wie in Abb. 2a dargestellt ausgewählt. Vor der Verwendung von dCas9-RNPs als Diagnosewerkzeug ist die Entwicklung einer Methode zum Testen der Spezifität der Sonde unerlässlich. Dies wurde getestet, indem zwei verschiedene Nanostrukturen mit unterschiedlichen Barcodes und unterschiedlichen Überhängen mit DNA-Zielregionen erstellt wurden, die mit dem Wildtyp-Genom und dem resistenten Genom mit der Mutation identisch waren.

a, dCas9-Sonden und DNA-Nanostrukturen-Überhang-Schemata, die einzelne Basenunterschiede zwischen Sequenzen in crRNA-Sonde (mit dem PAM in Rot) und DNA-Überhang darstellen. Die einzelne Basenpaarveränderung findet sich im Kat315-Gen bei Isoniazid-resistentem Mycobacterium tuberculosis. Dargestellt sind zwei verschiedene DNA-Nanostrukturen mit unterschiedlichen Überhängen (grün und lila). b, Bindungsspezifität der Sonden, wenn beide DNA-Nanostrukturen hinzugefügt werden und nur eine entsprechende Sonde hinzugefügt wird. N > 65 Ereignisse für jedes Experiment. Eine Kontrollnanostruktur mit Ziel-DNA, die kein PAM enthielt, wurde ebenfalls getestet, wie in Grau dargestellt, wobei N > 165. Berechnungen wurden unter Verwendung der Gleichungen (1) und (2) durchgeführt. c, Quantifizierung markierter Ereignisse in Abhängigkeit vom variierenden relativen Konzentrationsverhältnis von DNA-Nanostrukturen (grün oder violett) in Lösung mit äquimolaren Konzentrationen der beiden dCas9-Sonden (Standardabweichung stellt eine Probe dar, die in mindestens zwei verschiedenen Poren gemessen wurde). Berechnungen wurden anhand der Gleichungen (3–6) durchgeführt. N > 85 Ereignisse für jede Bedingung. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung zwischen Nanoporen dar. d, Reproduzierte Experimente mit 11001- und 11111-Nanostrukturen-Barcode im Verhältnis 2:1 in Lösung mit äquimolaren Konzentrationen beider hinzugefügter dCas9-Sonden. Die verschiedenen Balken (1, 2 und 3) sind drei unabhängige Probenvorbereitungswiederholungen in drei verschiedenen Nanoporen. Berechnungen wurden anhand der Gleichungen (3–6) durchgeführt. N > 100 Ereignisse für jede Messung. In allen Experimenten wurden dCas9-Sonden im Überschuss zu den Ziel-DNA-Molekülen hinzugefügt.

Wir haben jeweils eine der dCas9-Sonden zu äquimolaren Konzentrationen der beiden DNA-Nanostrukturen hinzugefügt, wie in Abb. 2a dargestellt. Dies wurde durchgeführt, um die Bindungseffizienz und Spezifität jeder Sonde in Gegenwart des einzelnen Basenpaarwechsels zu testen, wie in Abb. 2b dargestellt. Wir fanden heraus, dass beide dCas9-Sonden eine hohe Spezifität für ihren perfekt passenden Zielüberhang aufwiesen, wobei über 94,7 % bzw. 94,0 % der DNA-Nanostrukturereignisse mit klaren Barcodes korrekt gekennzeichnet waren. Es wurde festgestellt, dass die Nanostrukturen mit einer Mutation, die nicht mit der getesteten Sonde übereinstimmte, eine Bindung von 5,3 % bzw. 6 % aufwiesen. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass eine Kontrolle ohne PAM-Sequenz und mit der violetten Sonde eine Bindung von 4,2 % aufwies (N = 169). Diese falsch positiven Ergebnisse sind höchstwahrscheinlich auf Knoten in der DNA während der Translokation zurückzuführen, die ähnliche Signale wie ein gebundenes dCas9-Protein in der Ereignisspur erzeugen können. Die zur Berechnung dieser Werte verwendeten Gleichungen finden Sie unter Methoden. Die Anzahl der Ereignisse unterscheidet sich zwischen den Experimenten aufgrund des Prozentsatzes klar gekennzeichneter, entfalteter Ereignisse, die nach der Messung in der Datenanalyse verwendet werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass wir mit sorgfältig entwickelten und getesteten Sonden die Bindung an dsDNA-Ziele mit Einzelnukleotidspezifität differenzieren können.

Eine weitere entscheidende Fähigkeit von Biosensor-Tools ist die Fähigkeit, die relative Häufigkeit von Zielsequenzen zu quantifizieren. Wir haben die quantitative Natur der Bindung von dCas9-Sonden an ihre Ziel-DNA getestet, indem wir äquimolare Mengen zweier crRNA-Sonden gemischt und das Verhältnis der beiden verschiedenen Ziel-DNA-Nanostrukturen variiert haben, die durch ihre jeweiligen Barcodes identifizierbar sind, wie in Abb. 2c dargestellt. Unter Verwendung der relativen Konzentrationen von DNA-Nanostrukturen mit jedem Barcode in den Verhältnissen 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 und 100:0 wurde festgestellt, dass das Verhältnis der Ereignisse mit dem Barcode und dem charakteristischen dCas9-Spike mit dem relativen übereinstimmt Konzentration hinzugefügt, wie in Abb. 2c zu sehen ist. Beispielsweise werden in diesen Experimenten vor der Verdünnung für Nanoporenexperimente insgesamt 3 nM DNA mit 50 nM jedes gebildeten RNP gemischt. Wenn man also 0,75 nM der 10011-Barcode-Nanostruktur und 2,25 nM der 11111-Barcode-Nanostruktur hinzufügt, wird man bei Zugabe äquimolarer Konzentrationen der RNPs immer noch feststellen, dass der Prozentsatz der Nanostrukturereignisse mit dem 10011-Barcode und einem dCas9-Spitze nahe bei 25 % liegt Die Anzahl der Nanostrukturereignisse mit einem 11111-Barcode und einem dCas9-Spike wird nahezu 75 % betragen. Wenn man weiß, dass die Konzentration des hinzugefügten 10011 0,75 nM betrug, kann man anhand der relativen Konzentration schließen, dass der andere Barcode 2,25 nM betragen würde. Diese Prozentsätze wurden auf die gemessenen Bindungseffizienzen für jede Sonde normalisiert, wie in den Methoden angegeben. Wir haben die Proben in mindestens drei verschiedenen Poren gemessen, um die Variabilität bei der Porenherstellung zu berücksichtigen, wie durch die Fehlerbalken dargestellt, und lieferten unabhängig von der verwendeten Pore konsistente Ergebnisse. Die Reproduzierbarkeit wurde weiter getestet, indem drei unabhängige Wiederholungen aus dem Schritt der Probenvorbereitung in drei verschiedenen Poren getestet wurden, wobei die Strukturen im Verhältnis 2:1 gemischt wurden. Die Standardabweichung zwischen den unabhängigen Wiederholungen betrug nur ~6 %, wie in Abb. 2d zu sehen ist. Darüber hinaus kann unsere Methode durch Zugabe mehrerer dCas9-Sonden zu einer gemischten DNA-Probe zur Quantifizierung der relativen Konzentrationen verschiedener DNA-Ziele in Lösung verwendet werden. Diese Kombination aus Quantifizierung relativer DNA-Konzentrationen in einer Mischung und der Spezifität zur Erkennung einzelner Basenpaaränderungen ist ein Proof of Concept für einen leistungsstarken Nanoporensensor für die Multiplex-DNA-Analyse.

Die Möglichkeit, CRISPR/dCas9-Sonden zur quantitativen Messung der Menge einer bestimmten DNA-Sequenz in einer Probe zu verwenden, hat viele Auswirkungen. Die DNA-Konzentration in Proben wurde in Nanoporen mit Methoden wie dem elektrophoretischen Einfangmodell27 und der kontrollierten Zählmethode28,29 gemessen. Methoden wie die kontrollierte Zählmethode basieren jedoch auf einer DNA-Kontrolle, die eine deutlich andere Länge als die unbekannte Probe aufweist30. Während unsere Methode einen internen Standard für den quantitativen Nachweis erfordert, sind keine Vorkenntnisse über die Größe der Ziel-DNA erforderlich. Die Spezifität der Methode wird durch die gebundenen dCas9-Sonden bestimmt. Man kann DNA-Marker oder mehrere dCas9-Sonden verwenden, um ein vorgefertigtes Spike-Muster auf der DNA zu erzeugen. Spike-Muster identifizieren einen DNA-Marker in einer bekannten Konzentration durch Mischen mit einer DNA-Probe in einer unbekannten Konzentration. Die Kombination ermöglicht die Bestimmung der relativen Konzentration des Ziels.

Das Verständnis der Zielspezifität von Sonden basierend auf Position und Basenpaaränderung der Mutation ist für die Entwicklung von dCas9-Sonden sowohl für die Genomtechnik als auch für CRISPR-Diagnosetechniken von entscheidender Bedeutung. Dies wurde anhand einer anderen DNA-Nanostruktur mit drei in Abb. 3a, b hervorgehobenen Überhängen untersucht. Wie in Abb. 3b zu sehen ist, haben wir einzelne Basenpaaränderungen in den Überhängen sowohl an der PAM-Stelle als auch an verschiedenen Positionen von der PAM-Stelle eingeführt, um den Effekt sowohl der Positions- als auch der Basenidentitätsfehlanpassung zu vergleichen. Die Sequenzen für diese Überhänge sind in der Ergänzungstabelle 4 zu finden und die Sequenzen für Hanteln, die Spikes erzeugen, sind in der Ergänzungstabelle 5 zu sehen. Die Bindung eines einzelnen dCas9-RNP-Komplexes (Abb. 3c) wurde anhand der verschiedenen nicht übereinstimmenden DNA-Nanostrukturen in getestet die Nanopore. Beispielereignisse sind in Abb. 3d zu sehen. Anschließend wurde das normalisierte Bindungsverhältnis für die Sonde an den verschiedenen Positionen mit den unterschiedlichen Basenpaaridentitäten berechnet und in Abb. 3e dargestellt. Die zur Berechnung des normalisierten Bindungsverhältnisses verwendeten Gleichungen finden Sie unter „Methoden“. Diese Berechnungen basieren auf der Normalisierung auf den Wert für die Bindung an die Kontrolle (Xcontrol (10)), der 33,7 % mit einer Standardabweichung von 2,4 % betrug, wie in der ergänzenden Abbildung 3 zu sehen ist. Wenn also festgestellt wird, dass eine Sonde einen Bindungsprozentsatz aufweist von 33,7 % würde dies einem normalisierten Bindungsverhältnis von 1,0 entsprechen. Die Normalisierung ist ein wesentlicher Schritt, da diese geringere Bindungseffizienz für diese Experimente auf einen Anstieg der Salzkonzentration im Puffer zurückzuführen ist. Bei mehr DNA-Hanteln muss eine höhere Salzkonzentration verwendet werden, um die Translokation der Nanopore zu verlangsamen, wie in der ergänzenden Abbildung 4 zu sehen ist. Dies verringert jedoch die Effizienz der Bindung, wie in der ergänzenden Abbildung 5 zu sehen ist.

a: Der dCas9-RNP, der zur Beurteilung der Spezifität gegenüber Mutationen verwendet wird. b, Kontrollnanostruktur mit Zielsequenz ohne Mutationen in der Überhangregion. c, Nanostruktur mit Überhängen mit Fehlpaarungen in der Ziel-DNA-Überhangregion. d, Schematische Darstellung der Nanostruktur, die die dCas9-Bindung an den Überhang und die entsprechende Nanoporen-Ereignisspur zeigt. Ganz links zeigt die Bindung des RNP an eine Nanostruktur mit drei Kontrollüberhängen. Das mittlere Ereignis repräsentiert die drei nicht übereinstimmenden Überhänge ohne beobachtete Bindung des RNP. Ganz rechts stellt die dCas9-RNP-Bindung an zwei der nicht übereinstimmenden Zielsequenzen dar, was auf eine geringe Spezifität hinweist. e, Balkendiagramme für jede mögliche unterschiedliche DNA-Basenmutation und -position, wobei das normalisierte Bindungsverhältnis mithilfe der Gleichungen (7–11) berechnet wird. N > 45 Ereignisse für jedes Experiment. Fehlerbalken sind das Ergebnis der Standardabweichung von der Normalisierung zur Kontrolle der Bindungseffizienz.

Mutationen eins, zwei und drei Basenpaare in der Nähe des PAM zeigen die niedrigsten Bindungseffizienzen, was darauf hindeutet, dass diese Stelle die höchste Spezifität für die dCas9-Bindung für diese gegebene Sonde aufweist. Da sich die Mutationen in der Nähe der distalen PAM-Region befinden, kommt es zu einem stetigen Anstieg der dCas9-Bindung. Dies steht im Einklang mit Erkenntnissen in der Literatur, dass proximale PAM-Basen für die erfolgreiche Identifizierung der PAM-Stelle und die anschließende Bindung durch dCas9 entscheidender sind (Lit. 31). Die Ergebnisse stimmen auch insofern mit der Literatur überein, als Basen in der PAM-distalen Region von dCas9 nicht so spezifisch für die dCas9-Bindung sind31.

In Übereinstimmung mit der Literatur treten DNA-Fehlpaarungen mit der höchsten relativen Bindung auf, weil die Fehlpaarungen „Wobble“-Basenpaarungen oder Watson-Crick-ähnliche Konformere annehmen32,33,34. Die am besten tolerierte Basenpaarung (rG-dT, rU-dG, rA-dC und rC-dA) ist ein Ergebnis des flexiblen DNA-Rückgrats, das leichte Verschiebungen in der Position der Nukleotide ermöglicht, daher der Name „Wobble“. Unsere Untersuchung der häufigsten fehlgepaarten DNA-RNA-Basenpaarungen zeigt, dass diese Wobble-Basenpaare von der PAM-Stelle bis zur Stelle 5 dominant sind. Dies legt nahe, dass Fehlpaarungen in der Basenpaarung in der Nähe der PAM-Stelle aufgrund des flexiblen DNA-Rückgrats toleriert werden Fehlausrichtung von Nukleotiden und dass diese Fehlpaarungen eine erfolgreiche DNA-RNA-Basenpaarung nicht behindern. Basen, die weiter von der PAM-Site entfernt sind und bei Position 5 beginnen, zeigen diese Präferenz für Wobble-Mismatch jedoch nicht. Dies deutet möglicherweise darauf hin, dass es, je weiter sich die Mutationen von der zentralen PAM-„Verankerungsstelle“ entfernen, andere externe Faktoren gibt, die zu der nicht übereinstimmenden Basenpaarung beitragen. Die Theorie, dass die „Wobble“-Basenpaarung die Spezifität beeinflusst, stimmt mit neueren Arbeiten überein, in denen der Einbau von Inosin in dCas9-gRNAs die Bindung an verwandte DNA-Sequenzen verringert, aber die Paarung mit Sequenzen ermöglicht, die einzelne Substitutionen an überlappenden Positionen tragen35. Darüber hinaus wurde in der Literatur die strukturelle Grundlage von Wobble-Effekten im Zusammenhang mit Cas9 ermittelt, was diese Behauptungen stützt36.

Die Bewertung der Single-Mismatch-Spezifität wurde in der Literatur ausführlich mit einer Reihe verschiedener Sonden untersucht. Während die meisten Sonden durchweg den PAM-Proximal-/Distal-Trend und den Wobble-Base-Trend anzeigen, unterscheidet sich jede Anleitung von Papier zu Papier. Beispielsweise stellten wir in unserer Studie eine Abnahme der Spezifität im Verhältnis zum allgemeinen Trend an Position 8 und eine deutlich erhöhte Spezifität an Position 10 fest. Frühere Untersuchungen haben zwar die Spaltungseffizienz gemessen, aber gezeigt, dass die Kernsequenz empfindlich auf Fehlpaarungen reagiert befindet sich an den Basenpaaren 4–7 stromaufwärts von PAM37. Andere Untersuchungen haben jedoch keinen großen Unterschied zwischen den Positionen 2 und 4 hinsichtlich der Spaltungseffizienz gezeigt, haben jedoch gezeigt, dass die Empfindlichkeit gegenüber Fehlpaarungen an den Positionen 11 und 13 zunimmt (Ref. 38). Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit dem Konzept, dass Sonden unterschiedliche GMT-Grade aufweisen, die wir in Abb. 4 untersuchen.

a, Sonde 1 und Sonde 2 wurden unter Verwendung der in Abb. 1 beschriebenen Nanostrukturen entworfen und verglichen. b, Vergleich der Bindungseffizienz der Sonden untereinander und mit der vorhergesagten Effizienz von CHOPCHOP (grau)39. N = 288 Ereignisse für Sonde 1 und N = 558 Ereignisse für Sonde 2. Fehlerbalken sind die Standardabweichung zwischen mindestens vier verschiedenen Messungen in verschiedenen Poren für jede Sonde. c, Balkendiagramme des Bindungsverhältnisses, normalisiert auf die Effizienz der Sonden zum Ziel. Die Empfindlichkeit gegenüber einzelnen Basenpaaränderungen variiert stark zwischen den beiden Sonden, was den Einfluss von GMT unterstreicht. Jedes Experiment hat mindestens N > 45 Ereignisse. d, Variationen von Sonde 2 mit Mutationen in gRNA. e, Vergleich zwischen der vorhergesagten Effizienz (grau) und der gemessenen Bindungseffizienz, wenn Mutationen in gRNA eingeführt werden. Jedes Experiment weist mindestens mehr als N > 55 Ereignisse auf. f, Balkendiagramme mit normalisierten Bindungsverhältnissen, die die Sondenabhängigkeit von GMT und große Bindungsvariationen zwischen Sonden mit eingeführten Mutationen darstellen. Jedes Experiment hat mindestens mehr als N > 55 Ereignisse.

Um die Nützlichkeit dieses Testtools hervorzuheben, wurden zwei in Abb. 4a dargestellte Sonden verglichen. Diese Sonden wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Vorhersagewerte unter Verwendung von CHOPCHOP, aber ähnlicher Bindungseffizienzen an Ziel-DNA-Strukturen ausgewählt, wie in Abb. 4b (Lit. 39) zu sehen ist. Obwohl der Vorhersageeffizienzwert für Sonde 2 niedrig war, wurde festgestellt, dass sie eine hohe Bindungseffizienz aufweist. Diese Lücke zwischen vorhergesagt und gemessen kann darauf zurückzuführen sein, dass der vorhergesagte Wert auf der Spaltungseffizienz und nicht auf der Bindung basiert, da bekannt ist, dass die beiden nicht direkt austauschbar sind22. Aufgrund des Fehlens von Berechnungstools zur Vorhersage der Bindung wurde jedoch CHOPCHOP verwendet, das einen vorhergesagten Wert für die Spaltungseffizienz liefert. Aufgrund der ähnlichen Bindungseffizienz wurde postuliert, dass die Sonden möglicherweise ähnliche Trends in der Spezifität einzelner Basenpaare aufweisen. Die ersten vier Basenpaare des PAM wurden mit Basen ausgetauscht, die keine Wobble-Basenpaare waren, was darauf hindeutet, dass die Sonden ein höheres Maß an Spezifität aufweisen sollten. Allerdings zeigte Sonde 2 eine sehr geringe beobachtete Empfindlichkeit gegenüber Mutationen einzelner Basenpaare mit einer sehr hohen normalisierten Bindungseffizienz, wie in Abb. 4c dargestellt. Trotz der hohen Bindungseffizienz macht dieser Mangel an Spezifität deutlich, dass diese Sonde als Werkzeug zum Nachweis einzelner Basenpaaränderungen in klinischen Proben nicht nützlich wäre. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der in Abb. 4c gezeigten Sonde 1 um eine hochspezifische Sonde, die sie als Diagnosewerkzeug nützlich machen würde. Dies zeigt die Notwendigkeit eines Assays wie dem in dieser Arbeit gezeigten, um die Spezifität von dCas9-Sonden vor der Implementierung in weiteren Experimenten zu testen. Aufgrund dieses interessanten Befundes wurde diese Sonde dann weiter getestet, indem einzelne Basenpaaränderungen in die gRNA-Sequenz eingeführt wurden, wie in Abb. 4d dargestellt. Trotz ähnlicher vorhergesagter Bindungseffizienzen zwischen den vier Sonden, wie in Abb. 4e dargestellt, variierten die gemessenen normalisierten Bindungseffizienzen erheblich. Dies unterstreicht die Behauptungen in der Literatur, dass die Effizienz des dCas9- und Cas9-RNP ausschließlich von der verwendeten gRNA abhängt, wobei verschiedene Guides unterschiedliche GMTs haben23,24. Die Einführung von Fehlpaarungen einzelner Basenpaare in der DNA hat einen völlig anderen Effekt als die Einführung von Basenpaaränderungen in der RNA an derselben Stelle, wie in Abb. 4f dargestellt. Nur ein einziger Basenpaarwechsel zwischen den Guides kann zu einem völlig unterschiedlichen Verhalten und einer völlig unterschiedlichen Empfindlichkeit gegenüber einzelnen Basenpaarwechseln führen. Aufgrund dieser einzigartigen Verhaltensweisen und der aktuellen Einschränkungen der Rechenwerkzeuge zur Vorhersage dieser Verhaltensweisen ist die in dieser Arbeit demonstrierte Assay-Technik für das fundierte dCas9-Sondendesign von wesentlicher Bedeutung.

In dieser Arbeit beleuchten wir das Potenzial der Verwendung von dCas9-Sonden für den hochspezifischen Nachweis von Basenpaaränderungen in der DNA. Wir differenzierten gemischte Sequenzen mit Einzelbasenpaarspezifität und quantifizierten die relativen DNA-Konzentrationen mithilfe von dCas9-Sonden. Um dCas9-Sonden für diese Anwendungen verwenden zu können, ist es jedoch wichtig, zunächst die Spezifität der Sonde zu bewerten. Daher haben wir einen Modelltest vorgestellt, der empfindlich und spezifisch für den Test von dCas9-Sonden ist. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Spezifität von Sonden zu überprüfen, bevor sie in diagnostischen und Gen-Editing-Kontexten verwendet werden.

Obwohl dieses System derzeit auf den Nachweis der dCas9-Bindung beschränkt ist, besteht die Möglichkeit der Translation auch als Instrument zur Messung der Spaltung. Es hat sich gezeigt, dass SpCas9 nach der Spaltung sehr stabil an die DNA gebunden bleibt40. In ähnlicher Weise spaltet Cas12a die distale PAM-Region des Ziels, bleibt jedoch im proximalen PAM-Bereich gebunden41. Es besteht das Potenzial, DNA-Nanostrukturdesigns ähnlich dem in dieser Arbeit diskutierten zu erneuern und zu testen, wie die Spaltung verschiedener Enzyme durch Fehlpaarungen in der Ziel-DNA beeinflusst werden kann.

Über die Prüfung der Spezifität hinaus veranschaulichen wir den Nutzen dieser Sonden im diagnostischen Bereich als Methode zur Bestimmung der relativen Konzentration. Konzentrationsmessungen sind besonders wichtig bei Krankheiten oder Erkrankungen. Die relative Häufigkeit eines bestimmten Bakteriums oder Virus ist relevant, um die Behandlung zu bestimmen oder eine Änderung der Behandlung zu rechtfertigen, beispielsweise aufgrund steigender Konzentrationen eines Resistenzmarkers. Wie wir hier gezeigt haben, besteht ein zusätzlicher Vorteil von dCas9-Sonden darin, dass sie möglicherweise zum Nachweis relativer Konzentrationen eines Krankheitserregers mit einer bestimmten Mutation verwendet werden können.

Unsere Methodik hat das Potenzial, auf Anwendungen übertragen zu werden, die über die in dieser Arbeit gezeigten hinausgehen, sowohl in der Diagnostik als auch in der Genbearbeitung. Mit einem erweiterten Satz von Barcodes kann es als hochspezifischer Hochdurchsatzansatz zur Untersuchung der dCas9-RNPs verwendet werden, um Hunderte von gRNAs in derselben Messung zu testen. Es gibt zwar In-vitro- und zellbasierte Hochdurchsatztechniken wie die Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung42, diese können jedoch je nach Endanwendung übertrieben sein. Ein Vorteil des Nanoporensystems besteht darin, dass einige interessante Sequenzen mit minimalen Probenmengen (fM-Konzentrationen pro Experiment) getestet werden können, was dem Benutzer Zeit und Ressourcen sparen kann. Eine Reduzierung der Enzymmengen sowie der Zielproben ist insbesondere in diagnostischen Anwendungsfällen1,43 und bei Untersuchungen der dCas9-Hemmung44 relevant, bei denen der Elektrophorese-Mobilitäts-Shift-Assay der De-facto-Standard ist. Im Hinblick auf die Entwicklung von Diagnostika wurde die Verwendung von dCas9 als Markierung auf nativer DNA bereits demonstriert2, und mithilfe des Nanoporen-DNA-Nanostruktursystems können dCas9-Sonden effizient entworfen und getestet werden.

Die Kombination aus Nanoporen-Sensorik und CRISPR/Cas-Molekular-Engineering-Techniken ermöglicht einen hochspezifischen Einzelmolekül-Ansatz zur Bewertung der Bindungseffizienz und Spezifität von CRISPR/dCas9-Sonden. Zu diesem Zweck haben wir DNA-Nanostrukturen erstellt, die einen DNA-Überhang enthalten, der so gestaltet werden kann, dass er unterschiedliche dCas9-Bindungsstellen aufweist, wobei unterschiedliche „Barcodes“ die Überhangsequenz identifizieren, um Multiplex-Messungen zu ermöglichen. Wir haben gezeigt, dass dieses System zur Beurteilung der Spezifität von dCas9-Sonden und der Guide-intrinsischen Fehlpaarungsintoleranz verschiedener Sonden verwendet werden kann. Dies ist besonders wichtig, wenn diese Sonden in diagnostischen Anwendungen zum Nachweis einzelner Basenpaaränderungen verwendet werden. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken bietet die Beurteilung der Bindung mit diesem System Vorteile hinsichtlich Geschwindigkeit und Spezifität.

Um zu beobachten, dass das CRISPR-dCas9-System spezifisch genug ist, um das einzelne Basenpaar zu erkennen, wurden DNA-Konstrukte mit unterschiedlichen „Barcodes“ und einer Überhangsequenz für dCas9 erstellt. Das DNA-Konstrukt wurde durch Paarung einer linearisierten 7,2 kbp einzelsträngigen (ss) M13mp18-DNA (GuildBiosciences) mit 190 komplementären Oligonukleotiden über Watson-Crick-Basenpaarung synthetisiert, um über einen Zeitraum von 1 Stunde in einem Thermocycler vollständige dsDNA zu erzeugen. Alle Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies synthetisiert und in IDTE (10 mM Tris-HCl und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,0) gelöst. Die Sequenzen sind in den Zusatzinformationen zu finden. Die Probe wird dann mit einem 100-kDa-Amicon-Filter gefiltert und zur Konzentrationsinformation in einem Nanotropfen-Spektrophotometer gemessen. Basierend auf der Nanotropfenmessung liegt die typische Ausbeute bei 75–95 %. Bei den Nanostrukturen in Abb. 1 befinden sich innerhalb der 190 Oligos fünf Gruppen gleichmäßig verteilter einfacher Hantel-Haarnadelmotive, um die Spitzen zu erzeugen, die als Barcode auf der DNA-Nanostruktur fungieren7. Jede Gruppe besteht aus 11 DNA-Hanteln, um einen einzelnen Spike zu erzeugen. Die genauen Sequenzen mit ihren Nummern sind in der Ergänzungstabelle 1 in den Zusatzinformationen nach einer früheren Arbeit7 aufgeführt. Der Überhang entstand durch den Austausch von Oligos Nos. 142 und 143 mit einem 90-bp-Oligo, das aus 30-bp-Segmenten besteht, die zum M13-Rückgrat passen, und 50 bp der spezifischen Sequenzen, die die Zielsequenzen enthalten, die wir testen wollten. Der 50 bp große dsDNA-Überhang ist nicht groß genug, um eine beobachtbare Stromblockade zu erzeugen. Diese Überhänge sind in der Ergänzungstabelle 2 für die Experimente in Abb. 2 und in der Ergänzungstabelle 3 für die Experimente in Abb. 4 angegeben. Für die zweite Nanostruktur, die in der Ergänzungsabbildung 3 gezeigt ist, sind die Oligos Nr. 44, 45, 81, 82, 118 und 119 wurden durch Überhangsequenzen ersetzt, wie in der Ergänzungstabelle 4 zu finden. Die Hanteln wurden durch Ersetzen der Oligos Nr. 44, 45, 81, 82, 118 und 119 hergestellt. 23–28, 60–65, 97–102, 134–139, 148–153 und 162–167 mit den Sequenzen in der Ergänzungstabelle 5. Alle Proben wurden in einem Lagerungspuffer aus 10 mM Tris 0,5 mM MgCl2 gelagert.

Katalytisch deaktiviertes Cas9 D10A/H10A (dCas9) aus Streptococcus pyogenes bindet an eine tracrRNA und eine sequenzspezifische RNA (crRNA), die beide von Integrated DNA Technologies synthetisiert und in IDTE (10 mM Tris-HCl und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,0) gelöst wurden ). Die Zielsequenzen für die crRNA für die Sonden wurden mithilfe einer Online-Software (http://chopchop.cbu.uib.no/)39 entworfen und sind in den Zusatzinformationen zu finden. Um die dCas9-RNPs zusammenzusetzen, wurden tracrRNA (200 nM), crRNA (250 nM) und dCas9 (100 nM) in einem salzarmen Puffer (25 mM HEPES-NaOH (pH 8,0), 150 mM NaCl und 1 mM MgCl2) inkubiert ) bei 25 °C für mindestens 20 Min.

Die zusammengesetzten dCas9-Sonden wurden dann mit den DNA-Nanostrukturen mindestens 20 Minuten lang bei 25 °C inkubiert, wobei mehr als typischerweise 15 dCas9-Sonden pro DNA-Bindungsstelle zugesetzt wurden. Die Proben, die mit dCas9 markierte DNA-Nanostrukturen enthalten, werden unmittelbar vor Beginn der Messung in der Nanopore je nach Nanostruktur auf 0,1–0,3 nM in einer 2 M LiCl, 1× TE-Pufferlösung oder 4 M LiCl, 2× TE verdünnt System.

Nanoporen werden aus handelsüblichen Quarzkapillaren (0,2 mm Innendurchmesser/0,5 mm Außendurchmesser Sutter Instruments) mit einem lasergestützten Pipettenzieher (P-2000, Sutter Instrument) auf etwa 15 Nanometer hergestellt. Wir haben einen Polydimethylsiloxan (PDMS)-Chip mit 16 konischen Nanoporen mit einem gemeinsamen cis-Reservoir und einzelnen trans-Reservoirs hergestellt. Detaillierte Anweisungen zur Herstellung finden Sie bei Bell et al.45. Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl)-Elektroden sind mit den cis- und trans-Reservoirs im Polydimethylsiloxan-Chip verbunden. Die Größe jeder Nanopore wird vor Beginn der Messungen geschätzt, indem eine Strom-Spannungs-Kurve im Basiselektrolyten erstellt wird. Das zentrale cis-Reservoir enthält die Probe und ist geerdet, während an das trans-Reservoir eine Vorspannung von 500 mV angelegt wird, um den DNA-Transport durch die Nanopore voranzutreiben. Die Messung wird dann durchgeführt, bis etwa 1.000 gefaltete und entfaltete Ereignisse erfasst sind, mit einem typischen Zeitbereich von 45 Minuten bis 2 Stunden, abhängig von der verwendeten Konzentration und der Nanopore. Typischerweise werden von diesen 1.000 Ereignissen 300 entfaltet und dann analysiert. Ein Beispiel für die gefalteten und entfalteten Ereignisse ist in der ergänzenden Abbildung 6 zu sehen.

Zur Erfassung der Stromsignale wurde der Patch-Clamp-Verstärker Axopatch 200B (Molecular Devices) verwendet. Der Aufbau wird im Whole-Cell-Modus betrieben, wobei der interne Filter auf 100 kHz eingestellt ist. Zur Rauschreduzierung kommt zusätzlich ein achtpoliger analoger Tiefpass-Bessel-Filter (900CT, Frequency Devices) mit einer Grenzfrequenz von 50 kHz zum Einsatz. Die angelegte Spannung wird über einen I/O-Analog-Digital-Wandler (DAQ-Karten, PCIe-6251, National Instruments) gesteuert, wobei ein Programm auf LabView 2016 verwendet wird, um gleichzeitig das aktuelle Signal mit einer Bandbreite von 250 kHz aufzuzeichnen.

Über die Labview-GUI werden experimentelle Daten als TDMS-Dateien (Technical Data Management Streaming) gespeichert. Zunächst wird ein Translokationsfinder-Python-Skript (Teil des Nanopyre-Pakets unter https://gitlab.com/keyserlab/nanopyre) verwendet, das die Ereignisse anhand der Rohspuren identifiziert und in einer HDF5-Datei speichert. Nach der ersten Translokationsfinder-Analyse werden die Ereignisse aus den HDF5-Dateien in Python eingelesen (unter Verwendung des Nanopro-Pakets https://gitlab.com/keyserlab/nanopro) und alle Ereignisse mit aktuellem Rauschen >15 pA werden verworfen. Die Parameter zum Auffinden der Spitzen basieren auf der manuellen Analyse der Parameter Schwelle, Höhe, Entfernung und Prominenz aus dem Python-Peakfinder-Paket. Dies wird bei den ersten zehn und letzten zehn Ereignissen getestet, um sicherzustellen, dass die Parameter konsistent sind und die Spitzen genau gefunden werden. Anschließend werden die Ereignisse nach der Anzahl der Spitzen sortiert. Nach der Sortierung werden die Ereignisse visuell analysiert und Ereignisse, die Falten oder Knoten aufweisen, die den Barcode stören, werden aussortiert. Unser Labor hat gezeigt, dass in den meisten Fällen bereits vier Ereignisse für eine positive Erkennung ausreichen, während neun richtige Ereignisse die Wahrscheinlichkeit einer positiven Erkennung auf über 90 % erhöhen (Ref. 46). Prozentsatz der Ereignisse mit dCas9-Bindung in Abb. 2b und 4 wird wie folgt berechnet:

In diesen Gleichungen stellt N11111 dCas9 die Anzahl der Ereignisse dar, bei denen sowohl der Barcode 11111 als auch dCas9 gebunden sind. N11111 Kein dCas9 würde die Anzahl der Ereignisse mit dem 11111-Barcode und ohne dCas9-Bindung darstellen.

Die Berechnungen der relativen Konzentration haben zusätzliche Parameter, da auch die Gesamtzahl der Ereignisse ohne dCas9-Bindung für beide Barcode-Nanostrukturen eine Rolle spielt. Bei Konzentrationsexperimenten gibt es immer einen gewissen Prozentsatz an Fehlern; Um dies zu berücksichtigen, stellt der normalisierte gebundene Prozentsatz die Gesamtzahl der Ereignisse mit einem bestimmten Barcode dar, gemessen in der Nanopore. Für die Ereignisse in Abb. 2c,d werden die folgenden Gleichungen verwendet:

Der erste Teil dieser Formel betrachtet nur Ereignisse mit dCas9-Grenze \(\frac{{N}_{11111{\,{\mathrm{dCas}}}9}}{{N}_{11111{\,{\ mathrm{dCas}}}9}+{N}_{11001{\,{\mathrm{dCas}}}9}}\), während der zweite Teil die Multiplikation mit der Gesamtzahl der Ereignisse mit dem gemessenen Barcode beinhaltet ( N11111 Kein dCas9 + N11111 dCas9). Dies normalisiert die Messungen basierend auf den relativen Konzentrationen, die in der Nanopore gemessen werden.

Für Abb. 3 wird eine andere Nanostruktur verwendet und die Werte für normalisierte Verhältnisse werden entsprechend geändert. Verhältnisse werden auf folgende Weise berechnet:

Dieses Normalisierungsverhältnis unterscheidet sich geringfügig und basiert auf der Bindungseffizienz der Ziel-gRNA an ihre Ziel-DNA-Sequenz. Jedes \({X}_{{{\mathrm{Position}}\; i}}\) repräsentiert eine andere Nichtübereinstimmung. XControl definiert als \(\frac{{\Sigma X}_{{{\mathrm{Control}}\; {\mathrm{Position}}}\mathrm{1,2,3}}}{3}\) ist die durchschnittliche Bindungseffizienz an jeder Position des Ziel-dCas9 an seine Ziel-DNA-Sequenz. Dabei wird das gemessene Verhältnis des dCas9-RNP zu seinem Ziel als Bindungsverhältnis von 1,0 behandelt und die anderen gemessenen Verhältnisse relativ dazu.

Die Bindungseffizienz (%) wird berechnet:

Für die Stichproben mit mehreren Messungen, wie im Text beschrieben, wurde die Standardabweichung der Grundgesamtheit wie folgt berechnet:

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Die in dieser Studie generierten Quellrohdaten sind unter https://doi.org/10.17863/CAM.96534 verfügbar.

Zur Datenerfassung wurde LabView 2016 verwendet. Der CHOPCHOP-Server (Version 3) ist unter https://chopchop.cbu.uib.no verfügbar. Der Python-Code für die lokale Installation ist unter https://bitbucket.org/valenlab/chopchop verfügbar. Skripte zur Nanoporen-Datenanalyse sind unter https://gitlab.com/keyserlab/nanopyre und https://gitlab.com/keyserlab/nanopro verfügbar.

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SES dankt für die Finanzierung durch Oxford Nanopore Technologies, Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) und Cambridge Trust. NEW dankt für die Finanzierung durch Oxford Nanopore Technologies, die Canada UK Foundation und das Postdoc-Büro der University of Cambridge. SY dankt für die Finanzierung durch das EPSRC (EP/S022953/1) und AD dankt für die Finanzierung durch das EPSRC (EP/L015889/1). UFK und KC danken für die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC-2019-POC PoreDetect 899538). Wir danken Z. Xuan und N. Ermann für ihre Unterstützung bei der Entwicklung von Datenanalysetools und C. Platnich für die hilfreiche Lektüre des Manuskripts und nützliche Vorschläge.

Nicole E. Weckman

Aktuelle Adresse: Institute for Studies in Transdisciplinary Engineering Education & Practice, Department of Chemical Engineering & Applied Chemistry, University of Toronto, Toronto, Kanada

Sarah Yorke

Derzeitige Adresse: Yusuf Hamied Department of Chemistry, Cambridge, Großbritannien

Akashaditya Das

Derzeitige Adresse: Department of Chemical Engineering, Imperial College London, London, Großbritannien

Cavendish Laboratory, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Sarah E. Sandler, Nicole E. Weckman, Sarah Yorke, Kaikai Chen und Ulrich F. Keyser

Abteilung für Pathologie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Akashaditya Das

Oxford Nanopore Technologies, Oxford Science Park, Oxford, Großbritannien

Richard Guitterez

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SES, NEW, RG und UFK hatten die Idee. SES, NEW und KC haben die Nanostrukturen entworfen. AD beriet beim Design des dCas9-Leitfadens. SES und SY führten die Experimente durch und analysierten die Nanoporendaten. SES, NEW und UFK haben den ersten Manuskriptentwurf verfasst. Alle Autoren trugen zur Diskussion und zur endgültigen Manuskriptversion bei.

Korrespondenz mit Ulrich F. Keyser.

NEW ist Mitbegründer und Berater von 52 North Health Ltd. RG ist Mitarbeiter von Oxford Nanopore Technologies. SES wird für ihre Doktorarbeit teilweise von Oxford Nanopore Technologies finanziert. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Kiana Aran, Weihua Guan und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildungen, Tabellen und Referenzen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sandler, SE, Weckman, NE, Yorke, S. et al. Erfassung der DNA-Fehlpaarungstoleranz von katalytisch inaktivem Cas9 über barcodierte DNA-Nanostrukturen in Festkörpernanoporen. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01078-2

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Eingegangen: 19. Oktober 2022

Angenommen: 30. Juni 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01078-2

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