Bildgebung

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12749 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die epigenetische Dysregulation des Chromatins ist eines der Kennzeichen der Krebsentstehung und -progression und wird kontinuierlich als potenzieller allgemeiner Biomarker dieser komplexen Krankheit untersucht. Einer der Kernfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind, ist das einzigartige DEK-Protein – ein Histon-Chaperon, das die Chromatin-Topologie moduliert. Die DEK-Expressionsniveaus steigen von normalen Zellen zu Krebszellen deutlich an, was die Möglichkeit der Verwendung von DEK als Tumormarker erhöht. Obwohl bekannt ist, dass DEK an der epigenetischen und transkriptionellen Regulation beteiligt ist, sind die Einzelheiten dieser Wechselwirkungen und ihre Relevanz für die Krebsentstehung weitgehend unklar. In dieser Arbeit untersuchten wir die räumliche Korrelation zwischen der nuklearen Verteilung von DEK und Chromatinmustern – neben dem Fortschreiten des Brustkrebses – mithilfe der Bildkreuzkorrelationsspektroskopie (ICCS) in Verbindung mit der Proximity Ligation Assay (PLA)-Analyse. Wir haben unsere Studie an dem Modell durchgeführt, das auf drei gut etablierten menschlichen Brustzelllinien basiert, um die Heterogenität dieses Tumors zu berücksichtigen (MCF10A-, MCF7- und MDA-MB-231-Zellen). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression von DEK mit der insgesamt höheren räumlichen Nähe zwischen DEK und Histonmarkierungen korreliert, die Genpromotorregionen (H3K9ac, H3K4me3) entsprechen, obwohl sie nicht mit der räumlichen Nähe zwischen DEK und Genverstärkern (H3K27ac) korreliert. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass die kolokalisierenden Anteile von DEK und Histonmarkierungen beim nicht-invasiven Zellsubtyp geringer sind als bei der hochinvasiven Zelllinie (MDA-MB-231). Daher legt diese Studie nahe, dass die Rolle von DEK in transkriptionell aktiven Chromatinregionen je nach Subtyp der Brustkrebszelllinie variiert.

Der physiologische Zustand der Chromatin-DNA wird auf der Grundlage einer komplexen Armada von Prozessen aufrechterhalten, die konzertiert zusammenarbeiten, um die DNA-Regulierung sicherzustellen. Unter allen beteiligten Mechanismen stellt die Modifikation von Histonen eines der Kennzeichen dar1. Diese Modifikationen – z. B. Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung – werden oft als „epigenetischer Code“2 bezeichnet, da sie die Zugänglichkeit der Transkriptionsmaschinerie zur DNA beeinflussen, ohne die DNA-Sequenz direkt zu verändern. Tatsächlich spielt der epigenetische Code eine entscheidende Rolle bei der Orchestrierung der meisten DNA-bezogenen Prozesse. Nicht-physiologische Ausmaße an Histonmodifikationen treten häufig bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen auf – z. B. Autoimmunerkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs3 – und sind daher häufig am Prognoseprozess beteiligt4. Im Zusammenhang mit Brustkrebs beispielsweise führt das Ungleichgewicht der Acetylierung und Methylierung von Histonschwänzen zu einer ungewöhnlichen Öffnung oder Schließung der Chromatinstruktur5, und mehrere andere epigenetische Merkmale, z. B. Ubiquitinierung, sind stark dereguliert6,7,8,9, 10,11,12. Generell könnte die Veränderung des normalen epigenetischen Musters einen der ersten Schritte im Prozess der onkogenen Transformation darstellen13.

Histonmodifikationen regulieren die Genexpression, indem sie die räumliche Zugänglichkeit verschiedener Proteine, die an den Schritten des Transkriptionsprozesses beteiligt sind, zum Genom modulieren – oft als Transkriptionsmaschinerie bezeichnet. Allerdings ist die Histonmodifikation nicht der einzige Mechanismus, der die Genregulation beeinflusst: Tatsächlich spielen eine Vielzahl von Proteinen bei diesem Ziel eine wichtige Rolle, da sie an den verschiedenen Schritten des Transkriptionsprozesses beteiligt sind. Einer der zellulären Faktoren, die an der Genregulation beteiligt sind, ist das DEK-Protein, das auch an mehreren onkogenen Mechanismen beteiligt ist14,15. Eine Überexpression des DEK-Proteins ist durchweg mit einer erhöhten Zellproliferation, einem Fortschreiten des Tumors, einer schlechten Prognose der Patienten und folglich einem fortgeschrittenen Krebsstadium verbunden. Darüber hinaus bindet dieser allgegenwärtige Kernfaktor an viele stark und häufig exprimierte Gene16 und ist an der Genregulation in Brustkrebszellen17 beteiligt. In diesem Zusammenhang ist es von großem Interesse, die Wechselwirkungen von DEK mit der offenen Chromatinstruktur weiter zu untersuchen. Zu diesem Zweck haben wir uns für die mehrfarbige konfokale Fluoreszenzmikroskopie entschieden, eines der leistungsstärksten und vielseitigsten Instrumente zur Untersuchung der räumlichen Koverteilung von Kernproteinen. Um den durch die Rohbilddaten abgerufenen Informationsgehalt zu erhöhen, haben wir die pixelbasierte Bildkreuzkorrelationsspektroskopie (ICCS)-Analyse genutzt, die kürzlich in einem ähnlichen Kontext angewendet wurde18,19,20. Dank des ICCS-Ansatzes ist es möglich, die Kolokalisierung von DEK mit Chromatinmarkern zu charakterisieren und so eine indirekte Messung ihrer funktionellen Wechselwirkungen zu erhalten. Um diese potenziellen Wechselwirkungen validieren zu können, ist es oft von Vorteil, den bildgebenden Kolokalisationsassay durch In-situ-Techniken zu ergänzen – z. B. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) oder In-vitro-Co-Immunpräzipitation. In unserer Studie haben wir die ICCS-Analyse mit dem Proximity Ligation Assay (PLA) abgeglichen, einer vielversprechenden Lösung zur Visualisierung der Nähe auf der Nanometerskala zwischen zwei markierten Faktoren21,22. Tatsächlich nutzt diese Methode eine indirekte Immunfärbung und einen anschließenden Assay mit Enzymen, um die Wechselwirkungen endogener Proteine ​​aufzudecken, die weniger als 40 nm voneinander entfernt liegen23.

Hier verwendeten wir den ICCS-Ansatz und die PLA-Analyse, um die räumliche Korrelation zwischen der Kernverteilung des DEK-Proteins und dem Chromatinmuster im Zusammenhang mit dem Fortschreiten des Brustkrebses zu untersuchen. Wir analysierten die DEK-Landschaft in Kombination mit drei prominenten Histonmarkierungen, H3K4me3 und H3K9ac, die typischerweise mit transkriptionell aktiven Genpromotoren assoziiert sind, und H3K27ac, das an Genverstärkern gefunden wird, um ihre relativen räumlichen Verteilungen zu quantifizieren. Wir führten unsere Studie unter Nutzung eines gut etablierten Modells des Fortschreitens von Brustkrebs durch, d ,25; (ii) die MCF7-Zelllinie, nicht-invasiv und wenig aggressiv, mit geringem Metastasierungspotenzial26 und häufig zur Darstellung des reifen luminalen Subtyps verwendet, der sowohl die Östrogen- als auch die Progesteronrezeptoren (ER+, PR+) exprimiert; und (iii) die invasive metastatische basalähnliche Zelllinie MDA-MB-231, die den am schwierigsten zu behandelnden Brustkrebstyp darstellt: das dreifach negative Adenokarzinom (ER-, PR-, HER2-), das für die epitheliale- zum mesenchymalen Übergang (EMT)27,28.

Zunächst untersuchten wir die Kernverteilung des DEK-Proteins unter den drei ausgewählten Brustkrebszelllinien mithilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 1). Ähnlich wie bei anderen Mikroskopiestudien15,29,30,31 beobachteten wir das erwartete Kernmuster von DEK in jeder Zelllinie: Das Fluoreszenzsignal erschien innerhalb des Kerns gleichmäßig, an seiner Peripherie verringerte sich die Intensität und in den Nukleolen fehlte es. In MDA-MB-231-Zellen zeigte die höhere Fluoreszenzintensität – im Vergleich zu MCF10A- und MCF7-Zellen – die DEK-Überexpression, die typisch für fortgeschrittenere Stadien der Krebsprogression ist32.

Konfokale DEK-Protein-Bildgebung in Modell-Brustkrebszelllinien. Die Kernverteilung des DEK-Proteins in MCF10A-, MCF7- und MDA-MB-231-Zellen repräsentiert den nicht-malignen, metastasierten, nicht-invasiven bzw. metastasierten, hochinvasiven Krebszustand. Die Nachschlagetabelle (LUT) unter jedem Bild gibt den minimalen und maximalen Grauwert eines 12-Bit-Bildes an. Maßstabsbalken = 5 μm.

Eine wachsende Zahl von Studien deutet auf einen Zusammenhang zwischen veränderten posttranslationalen Modifikationen von Proteinen und dem Fortschreiten von Brustkrebs hin9,11,33,34. Daher haben wir für die weitere Analyse drei posttranslationale Histonmodifikationen ausgewählt, deren Häufigkeit mit Brustkrebs assoziiert ist: (i) H3K9ac, eine Histonmarkierung aktiver Genpromotoren; (ii) H3K27ac, eine etablierte Marke für aktive Verstärker35 oder Superverstärker36,37; und (iii) H3K4me3, eine Histonmarkierung aktiver Genpromotoren. Die Literatur belegt den Zusammenhang zwischen niedrigen/mäßigen Nachweiswerten für die H3K9ac-Modifikation im Western Blot und einer schlechten Prognose10, auch wenn diese Histonmarkierung oft mit einem bestimmten Gen korreliert, das an der Krebsprogression beteiligt ist38. Stattdessen wird angenommen, dass das Auftreten von H3K27ac im Tumorgewebe der Brust zunimmt9. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass für H3K4me3 eine hohe Intensität der immunhistochemischen Färbung des Zellkerns mit H3K4me3 mit einer geringeren 10-Jahres-Überlebensrate und einer geringeren brustkrebsspezifischen Überlebensrate korreliert8.

In unserem Modell untersuchten wir die räumliche Kolokalisierung jeder der ausgewählten posttranslationalen Modifikationen und des DEK-Proteins, um ein neues Licht auf ihre möglichen funktionellen Beziehungen und insgesamt auf die Rolle von DEK bei der Brustkrebsentstehung zu werfen. Zu diesem Zweck nutzten wir bildbasierte Ansätze und nutzten sowohl die Analyse der Bildkreuzkorrelationsspektroskopie (ICCS) als auch die Methoden des Proximity Ligation Assay (PLA). Das ICCS wurde bereits zur Erkennung dynamischer Wechselwirkungen nicht nur mithilfe der konfokalen Bildgebung, sondern auch im Zusammenhang mit hochauflösender Mikroskopie wie SIM39 oder SMLM20 eingesetzt. Stattdessen bietet PLA eine umfassende Möglichkeit zur qualitativen Prüfung der Existenz nanoskaliger Nähe und potenzieller Protein-Protein-Wechselwirkungen in einem immunbasierten experimentellen Design22,40,41. Unsere ICCS-Analyse zweifarbiger konfokaler Bilder (Abb. 2A) ergab, dass die relative Verteilung von DEK mit Euchromatinstellen korreliert (Abb. 2B). Insbesondere beobachteten wir, dass der kolokalisierte DEK-Anteil bei jeder der untersuchten H3-Modifikationen für die invasive metastatische MDA-MB-231-Zelllinie im Vergleich zu den anderen Zelllinien signifikant und durchweg höher war. Die Häufigkeit von DEK an diesen aktiven Chromatinmarkierungen könnte darauf hindeuten, dass bei metastasiertem und invasivem Brustkrebs-Phänotyp eine DEK-Rekrutierung an den Gentranskriptionsstellen erforderlich ist. Der einfaktorielle ANOVA-Test der ICCS-Werte zeigte signifikante Unterschiede zwischen den drei Zelllinien hinsichtlich der Kolokalisation von DEK mit H3K9ac und H3K4me3, jedoch nicht mit H3K27ac. Interessanterweise ist für H3K4me3 und H3K9ac der kolokalisierte Anteil mit DEK in MCF7-Zellen geringer als in MCF10A-Zellen. Dieses Ergebnis kann dadurch erklärt werden, dass spezifische Acetylierungs- oder Methylierungsereignisse am Histon H3 bei verschiedenen Subtypen von Brustkrebs je nach Zielgen unterschiedlich reguliert werden, wie kürzlich gezeigt wurde38. Für H3K27ac und DEK war der durchschnittliche Kolokalisationsanteil in MDA-MB-231-Zellen (0,59 ± 0,09) signifikant höher im Vergleich zum durchschnittlichen Kolokalisationsanteil in MCF10A-Zellen (0,26 ± 0,06, p < 0,0167) und MCF7-Zellen (0,30 ± 0,08 p <). 0,0167). Für die Kolokalisierung von H3K27ac und DEK gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen MCF10A- und MCF7-Zellen (p = 0,18). Darüber hinaus zeigt die globale Genexpressionsprofilierung von Brusttumorzelllinien signifikante Unterschiede zwischen Krebssubtypen in der Menge exprimierter Gene42. Insbesondere die Enhancer-assoziierten Chromatinzustände sind in den verschiedenen Brustkrebszelllinien am variabelsten7.

Korrelation zwischen DEK-Proteinverteilung und aktiven Chromatinregionen im menschlichen Brustkrebsmodell. (A) Konfokale Bilder von co-immungefärbten Brustkrebs-Modellzelllinien mit DEK-Protein und H3K4me3-, H3K9ac- oder H3K27ac-Histonmodifikationen. Maßstabsbalken = 5 μm. (B) Säulenbalkendiagramme, die Mittelwerte kolokalisierter Fraktionen darstellen, die aus der ICCS-Analyse extrahiert wurden. (C) Boxplot-Diagramme der quantitativen Analyse der PLA-Spots. Für (B) und (C) wurde die statistische Signifikanz zwischen allen Gruppen (p < 0,0167, markiert mit einem Sternchen) durch eine einfache ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test bestimmt.

Die biologischen Auswirkungen von Proteinen auf den Zellzustand hängen nicht nur mit ihren unterschiedlichen Expressionsniveaus zusammen, sondern auch mit der veränderten Interaktion mit anderen zellulären Faktoren. Daher haben wir die oben aufgeführten potenziellen Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen DEK und den Euchromatin-Histon-Markierungen überwacht. Zu diesem Zweck haben wir PLA durchgeführt, das die Nähe im Nanometerbereich – und damit die möglichen Wechselwirkungen – zwischen immungefärbten Molekülen erkennt. Insbesondere haben wir die PLA-detektierten Punkte aus konfokalen Z-Stapel-Bildern analysiert. Die Lage von PLA-Herden im Zellkern weist darauf hin, dass sie sich in Chromatinregionen mit geringerer DNA-Dichte bilden (Suppl. Abb. 1). Nach der Durchführung eines einfaktoriellen ANOVA-Tests stellten wir fest, dass es einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der durchschnittlichen Anzahl von PLA-Spots in den drei untersuchten Zelllinien gab (Abb. 2C). Für DEK und H3K4me3 sowie DEK und H3K9ac beobachten wir in MDA-MB-231-Zellen etwa doppelt so viele PLA-Spots wie in MCF10A- und MCF7-Zellen. Stattdessen gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der durchschnittlichen Anzahl der PLA-Spots zwischen MCF10A-Zellen und MCF7-Zellen (für H3K9ac und DEK, p = 0,485, für H3K4me3 und DEK, p = 0,498). Diese Ergebnisse – validiert durch eine Reihe von Positiv- und Negativkontrollen (Suppl. Abb. 2) – bestätigen und bereichern unsere ICCS-Analyse: In MDA-MB-231-Zellen lokalisiert sich das DEK-Protein in der Nähe von H3K4me3 und H3K9ac und scheint zu interagieren mit Euchromatin-Markierungen mehr als in nicht-malignen MCF10A- oder nicht-invasiven MCF7-Zellen. Interessanterweise zeigt die PLA-Analyse, dass – für MDA-MB-231-Zellen – die molekulare Nähe zwischen DEK und H3K9ac im Vergleich zu MCF10A (19,9 ± 7,9, p < 0,0167) deutlich höher ist (40,5 ± 8,9) (Abb. 2C). MCF7-Zellen (21,1 ± 5,9, p < 0,0167). Dies legt die besondere Bedeutung von DEK für die Gensequenzen nahe, die durch die Acetylierung von Histon H3 an Lysin 9 gekennzeichnet sind. Es wäre von großem Interesse, weiter zu untersuchen, welcher bestimmte Genpromotor dieses epigenetische Profil aufweist und wie es durch die Anwesenheit von DEK reguliert werden könnte Protein in seiner Nähe.

Es ist bekannt, dass DEK in MDA-MB-231-Zellen überexprimiert wird32,43 und auf konfokalen Bildern eine höhere Fluoreszenzintensität aufweist als in MCF10A- oder MCF7-Zellen. Die ICCS-Analyse zeigte, dass DEK in MDA-MB-231-Zellen in deutlich höherem Maße mit H3K27ac kolokalisiert als in den beiden anderen Zelllinien. Die Anzahl der PLA-Spots spiegelt diesen Trend jedoch nicht wider. Die statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen MCF7- und MDA-MB-231-Zellen (p = 0,645) hinsichtlich der durchschnittlichen Anzahl von PLA-Spots, die für DEK und H3K27ac spezifisch sind. Interessanterweise war diese Zahl bei MCF10A-Zellen (10,1 ± 4,3) niedriger als bei MCF7 (17,3 ± 5,5, p < 0,0167) und MDA-MB-231-Zellen (16,5 ± 6,6, p < 0,0167). Obwohl beide Proteine ​​in MDA-MB-231-Zellen räumlich kolokalisieren (fICCS = 0,59 ± 0,09), deuten die letzten Ergebnisse möglicherweise darauf hin, dass sie nicht in einer Nähe von weniger als 40 nm bleiben, was darauf hindeutet, dass sie nicht interagieren. Dank der Kombination unserer auf Mikroskopie und Bildgebung basierenden Ansätze konnten wir die Wechselwirkungen und die räumliche Nähe zwischen den Proteinen in intakten Zellen bestimmen, was in Zukunft durch die Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente ergänzt werden könnte. Basierend auf unserer Studie können wir jedoch die Hypothese aufstellen, dass DEK bei diesem Brustkrebs-Subtyp in der Nähe der Gen-Enhancer (oder Super-Enhancer) weniger vorhanden ist.

In dieser Studie analysierten wir die räumliche Korrelation zwischen DEK und Euchromatin-Markierungen im heterogenen Brustkrebsmodell, das aus den Zelllinien MCF10A, MCF7 und MDA-MB-231 besteht. Spezifische Kreuzkorrelationsfunktionssignaturen wurden hervorgehoben und durch die PLA-Analyse ergänzt. Unsere auf Mikroskopie-Bildgebung basierenden Daten zeigen, dass die Überexpression des DEK-Proteins mit einem höheren Maß an räumlicher Nähe zwischen DEK und H3K4me3 und zwischen DEK und H3K9ac korreliert, jedoch nicht mit diesem Merkmal zwischen DEK und H3K27ac. Wir vermuten, dass dies mit der potenziell erhöhten Aktivität von DEK auf Genpromotoren zusammenhängen könnte. Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse den molekularen Zusammenhang zwischen dem DEK-Protein und der Regulierung aktiver Stellen des Chromatins im Brustkrebsmodell. Die Neuheit dieser Studie liegt im Nachweis, dass DEK bevorzugt in der Nähe von Gen-Promotorregionen und nicht in der Nähe von Gen-Enhancern bleibt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Ergebnisse dieser Studie auf die vielfältigen Rollen des DEK-Proteins beziehen und im Allgemeinen den Weg für weitere Untersuchungen der epigenetischen Mechanismen der Krebsentstehung ebnen.

Brustepitheliale, nicht transformierte MCF10A-Zellen (ATCC CRL-10317) wurden in DMEM:F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12) (1:1) Medium (Gibco, 11330057), ergänzt mit 5 % Pferd, gezüchtet Serum (HS), 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma-Aldrich, G6784), 10 µg/ml Insulin (Sigma-Aldrich, I9278) und 0,5 µg/ml Hydrocortison (Sigma-Aldrich, H0888). Der humane epidermale Wachstumsfaktor (hEGF, Sigma-Aldrich, E9644) wurde vor der Verwendung des Vollmediums (20 nm/ml) frisch zugegeben. MCF7-Zellen und MDA-MB-231-Zellen (ATTC HTB-26) wurden in DMEM-Medium (Gibco, 11330057) gezüchtet, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Euroclone, ECS0180L), 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma-Aldrich, G6784) und 2 mM L-Glutamin. Die Zellen wurden einen Monat lang (etwa 10–12 Zellpassagen) bei 37 °C in 5 % CO2 auf 10-cm2-Petrischalen gezüchtet. Für alle Experimente mit fixierten Zellen wurden die Zellen auf Glasdeckgläsern ausplattiert, die mit 0,5 % (Gew./Vol.) Schweinegelatine (Sigma-Aldrich, G2500) beschichtet waren, die zuvor in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst und autoklaviert wurde.

Zum Nachweis des interessierenden Proteins wurden die Zellkulturen dreimal mit vorgewärmtem PBS gewaschen und 15 Minuten lang mit Formaldehyd (3,7 %, methanolfrei) fixiert. Nach der anschließenden Blockierung mit dem Blockierungspuffer bestehend aus 0,1 % Triton C) und Sekundärantikörper (1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln): α-DEK (Maus, Santa Cruz, sc-136222, 1:50), α-H3K9ac (Kaninchen, Invitrogen, 710293, 1:250), α -H3K4me3 (Kaninchen, Abcam, Ab8580, 1:250), α-H3K27ac (Kaninchen, Invitrogen, 720096, 1:500), α-PCNA (Kaninchen, Sigma-Aldrich, HPA030522, 1:50), Ziegen-α-Maus Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11001, 1:250), Ziegen-α-Kaninchen Atto 532 (Rockland, 611-153-122, 1:200). Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern wurden die Zellen dreimal mit PBS gespült und bei Bedarf 20 Minuten bei RT mit TO-PRO™-3-Iodid (Invitrogen, 1:2000) inkubiert und erneut dreimal mit PBS gespült. Die Proben wurden in ProLong™ Diamond Antifade Mountant (Invitrogen, P36961) montiert. Die Positivkontrolle für die ICCS-Analyse wurde an einigen zwei DNA-Replikationsmarkierungen durchgeführt: EdU Click-iT (mit Alexa Fluor 594) gefärbte Replikationsherde und PCNA-Replikationsprotein.

Nach der Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden die Proben für den Proximity Ligation Assay (PLA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma-Aldrich) unter Verwendung des DuoLink® in situ Orange-Nachweisreagenz (DUO92102) verarbeitet. Zunächst wurde die Probe 60 Minuten lang bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer in PLA-Blockierungslösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang bei RT mit primären Antikörpern in Antikörperlösung inkubiert: Anti-DEK-Maus-Antikörper (Santa Cruz, sc-136222, 1:50) und α-H3K9ac (Kaninchen, Invitrogen, 710293, 1:250). α-H3K4me3 (Kaninchen, Abcam, Ab8580, 1:250), α-H3K27ac (Kaninchen, Invitrogen, 720096, 1:500), α-H3K9me2 (Maus, Abcam, Ab1220, 1:200), α-H3K9me3 (Kaninchen , Abcam, Ab8898, 1:500). Nach dem anschließenden Waschen mit dem Waschpuffer A führten wir den Ligationsschritt 30 Minuten lang bei 37 °C und den Amplifikationsschritt 100 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln durch. Nach dem Waschen mit Waschpuffer B und PBS wurden die Zellen mit dem Sekundärantikörper Anti-Maus Alexa Fluor 488 (ThermoFisher, A11001, 1:250) und 20 Minuten bei RT mit TO-PRO™-3 Iodide (Invitrogen) inkubiert , 1:2000) bei Bedarf gereinigt und mit PBS gewaschen. Alle Proben wurden in ProLong™ Diamond Antifade Mountant montiert.

Die Messungen wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP5 unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs HCX PL APO 100 ×/1,40–0,70 (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Die Anregung erfolgte mit einem Weißlichtlaser (SuperK, NKT) bei der gewünschten Wellenlänge für jeden Farbstoff: 488 nm (für Alexa Fluor 488), 532 nm (für Atto 532), 554 nm (für Quasar 570), 642 nm (für ToPro3) mit relevanten Emissionsdetektionsbändern 495–525 nm (für Alexa Fluor 488), 540–620 nm (für Atto 532), 560–625 nm (für Quasar 570) und 650–700 nm (für ToPro3). Signale in verschiedenen Kanälen wurden mit Photomultipliern (PMT) oder Hybriddetektoren (HyD) erfasst. In den meisten Fällen wurden 512 × 512 Pixel große Bilder mit einer Pixelgröße von 40 nm aufgenommen.

Konfokale Mikroskopiebilder wurden mit ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) verarbeitet. Der Kontrast der Bilder wurde angepasst, um schwächere Fluoreszenzsignale anzuzeigen. Die Anzahl der PLA-Spots wurde mithilfe eines Plugin-3D-Objektzählers aus konfokalen Z-Stack-Bildern ermittelt.

Für die Analyse der 2D-Bildkreuzkorrelationsspektroskopie (ICCS) haben wir den von den Autoren des Originalartikels18 entwickelten Open-Source-MatLab-Code auf eine Reihe konfokaler Mikroskopiebilder angewendet. Kurz gesagt bezieht sich die ICCS-Analyse auf die räumliche Variante der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)44,45 und der Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS)46. ICCS wendet den gleichen Formalismus auf die Analyse der räumlichen Intensitätsschwankungen zwischen zwei Signalen in der Zelle an. Der ICCS-Algorithmus ruft den kolokalisierten Anteil (fICCS) aus der Anpassung der Bild-Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen ab47,48. Die vom ICCS abgerufene kolokalisierte Fraktion ist unabhängig von der Fokusdichte, was sie gegenüber objektbasierten Ansätzen vorteilhaft macht, insbesondere wenn auf Fokusse mit hoher Dichte abgezielt wird18. Die zweidimensionalen (2D) Korrelationsfunktionen wurden wie folgt berechnet:

Dabei sind I1(x,y) und I2(x,y) die Bilder im ersten bzw. zweiten Kanal und die spitzen Klammern geben die Mittelung über alle ausgewählten Pixel des Bildes an. Die beiden Autokorrelationsfunktionen wurden durch Setzen von i = j = 1 bzw. i = j = 2 erhalten, während die Kreuzkorrelationsfunktion durch Setzen von i = 1 und j = 2 erhalten wurde. Die 2D-Korrelationsfunktionen wurden dann in radiale Korrelationsfunktionen umgewandelt -dimensionale Korrelationsfunktionen Gij(δr) durch Berechnen eines Winkelmittelwerts, wie zuvor beschrieben49. Die resultierenden radialen Korrelationsfunktionen wurden dann an ein Gaußsches Modell angepasst:

Dabei ist Gij(0) der Amplitudenparameter, wij ein Breitenparameter und Gij(∞) ein Offset. Schließlich wurde der Kolokalisationsanteil f als f = [G12(0)/G22(0) + G12(0)/G11(0)]/2 berechnet.

Um zu testen, ob es statistisch signifikante Unterschiede in den Mittelwerten zwischen Zelllinien (der Anzahl der PLA-Spots und der ICCS-Durchschnittswerte) gibt, wurde der einfaktorielle ANOVA-Test durchgeführt. Die Unterschiede der Varianzwerte wurden mithilfe des F-Tests berechnet, gefolgt von Student-t-Tests mit zwei Stichproben für jeden untersuchten Paardatensatz, unter der Annahme der zweiseitigen Verteilung und der entsprechenden homoskedastischen oder heteroskedastischen Varianz. Um den Typ-I-Fehler des t-Tests zu vermeiden, haben wir die Bonferroni-Korrektur für die p-Werte durchgeführt50.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Bildkreuzkorrelationsspektroskopie

Förster-Resonanzenergieübertragung

Proximity-Ligationsassay

Varianzanalyse

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. Mario Faretta von der Abteilung für experimentelle Onkologie, Europäisches Institut für Onkologie, Mailand, Italien, für die MCF10A-Zellen, Prof. Heiko Hermeking vom Labor für experimentelle und molekulare Pathologie, Ludwig-Maximilians-Universität München, Deutschland, für die MCF7-Anrufe und Dr. Ferdinand Kappes vom Department of Biological Sciences, Xi'an Jiaotong-Liverpool University, Suzhou, China, für die Unterstützung und hilfreiche Diskussion.

AP-M. wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Stipendienvereinbarung Nr. unterstützt. 841661 (qCHROMDEK). LL dankt der Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) für die Unterstützung im Rahmen des Projekts MFAG 2018 – ID 21931.

Isolde Cainero

Aktuelle Adresse: IRCCS Ospedale Policlinico San Martino, Largo Rosanna Benzi 10, 16132, Genua, Italien

Nanoskopie und NIC @ IIT, Italienisches Institut für Technologie, Via Enrico Melen, 83, 16152, Genua, Italien

Agnieszka Pierzynska-Mach, Isotta Cainero, Michele Oneto, Luca Lanzanò und Alberto Diaspro

Fachbereich Biologie, Universität Konstanz, Konstanz, Deutschland

Elisa Ferrando-May

Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland

Elisa Ferrando-May

Institut für Physik und Astronomie, Universität Catania, Catania, Italien

Luca Lanzanò

DIFILAB, Fachbereich Physik, Universität Genua, Genua, Italien

Alberto Diaspro

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AP-M., LL und AD hatten die Idee. AP-M. führte die Zellkultur durch, bereitete die Proben vor und führte die Bildgebung und Datenerfassung durch. MO war an der Vorbereitung der Proben und der Diskussion beteiligt. AP-M., IC und LL implementierten die Software und analysierten die Daten. AD und LL betreuten das Projekt. AP-M. schrieb den Artikel mit Beiträgen aller Autoren. AP-M., IC, MO, LL, EF-M., AD überarbeiteten und redigierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Alberto Diaspro.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pierzynska-Mach, A., Cainero, I., Oneto, M. et al. Eine bildgebende Studie zeigt, wie die nanoskalige DEK-Verteilung unterschiedlich mit epigenetischen Markierungen in einem Brustkrebsmodell korreliert. Sci Rep 13, 12749 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38685-7

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Eingegangen: 11. Juli 2022

Angenommen: 12. Juli 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38685-7

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